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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung und Beschichtung der Multikompartiment-Chips
- Legen Sie den Chip in einer Biosicherheitswerkbank in eine Petrischale oder einen anderen geeigneten sterilen Behälter.
- Geben Sie 100 μl Vorbeschichtungslösung in die obere linke Vertiefung des Chips und lassen Sie sie durch den Hauptkanal in die angrenzende Vertiefung fließen.
Anmerkung: Die Vorbeschichtungslösung wird verwendet, um die mikrofluidischen Kanäle vorzucoaten, um das Risiko des Einschlusses von Luftblasen im Chip auszuschließen.
- Füllen Sie die untere linke Vertiefung mit 100 μl Anschwemmlösung. Warten Sie 5 Minuten, bis die Lösung durch die Mikrorillen fließen kann.
- Geben Sie 100 μl Anschwemmungslösung in die obere rechte Vertiefung und lassen Sie sie durch den Hauptkanal in die angrenzende Vertiefung fließen. Füllen Sie die untere rechte Vertiefung mit 100 μl Anschwemmlösung.
- Aspirieren Sie die Lösung aus jeder Vertiefung. Saugen Sie von den Hauptkanälen weg an, um zu vermeiden, dass Flüssigkeit aus den Hauptkanälen entfernt wird (Abbildung 1A). Geben Sie sofort 150 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die obere linke Vertiefung. Wartezeit 1,5 min.
Vorsicht: Saugen Sie nicht die gesamte Flüssigkeit aus den geschlossenen Hauptkanälen an.
- Geben Sie 150 μl PBS in die untere linke Vertiefung. Warten Sie 5 Minuten, damit die Flüssigkeiten durch die Mikrorillen fließen können. Geben Sie 150 μL PBS in die obere rechte Vertiefung. Geben Sie 150 μl PBS in die untere rechte Vertiefung. Warten Sie 10 Minuten.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.6 für eine zweite PBS-Wäsche.
- Überprüfen Sie den Chip unter einem Gewebekulturmikroskop auf Blasen in den Hauptkanälen. Wenn Blasen vorhanden sind, führen Sie die folgenden Schritte aus. Wenn keine Blasen vorhanden sind, fahren Sie mit Schritt 1.9 fort.
- Aspirieren Sie PBS aus den Vertiefungen, indem Sie die Pipettenspitze von der Kanalöffnung weg abwinkeln (Abbildung 1A).
Geben - Sie 100 μl Anschwemmungslösung in die obere Vertiefung und winkeln Sie die Spitze der Pipette in der Nähe der Kanalöffnung an (Abbildung 1B). Die Blasen sollten sich durch den Kanal in die untere Vertiefung bewegen. Warten Sie 1,5 Minuten.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3-1.8.
- Aspirieren Sie PBS aus den Vertiefungen, indem Sie die Pipettenspitze von der Kanalöffnung weg abwinkeln (Abbildung 1A).
- Geben Sie 100 μl 0,5 mg/ml Poly-D-Lysin (PDL) in die obere linke Vertiefung des Chips. Warten Sie 1,5 Minuten. Füllen Sie die untere linke Vertiefung mit 100 μl PDL.
- Geben Sie 100 μl PDL in die obere rechte Vertiefung des Chips. Warten Sie 1,5 Minuten. 100 μl in die untere rechte Vertiefung geben.
- Verschließen Sie die Petrischale und legen Sie den Chip für 1 h bei 37 °C in einen Inkubator.
- Wiederholen Sie die PBS-Waschschritte 1,5-1,6 zweimal, um überschüssiges PDL zu entfernen.
- Saugen Sie das PBS aus dem Gerät an.
- Geben Sie sofort 100 μl Zellkulturmedium in die obere linke Vertiefung des Chips. Warten Sie 1,5 Minuten. Fügen Sie Medien im unteren linken Feld hinzu. Fügen Sie Medien im oberen rechten Bereich hinzu. Warten Sie 1,5 Minuten. Geben Sie 100 μl Medium in die untere rechte Vertiefung des Chips.
- Legen Sie den Chip in den 37 °C heißen Inkubator, bis er bereit ist, die Zellen zu plattieren.
>2. Aussaat von Neuronen in die Multikompartiment-Chips
- Bereiten Sie die Zellsuspension von dissoziierten Hippocampus-Neuronen der Ratte gemäß etablierten Protokollen vor, um eine Dichte von ~12 × 106 Zellen/ml.
zu erhalten
Anmerkung: Die Verwendung von Zellsuspensionsdichten zwischen 3 und 12 × 106 Zellen/ml ist möglich. Wenn eine niedrigere Dichte verwendet wird, kann das Volumen der Zellsuspension, die dem Chip zugesetzt werden soll, erhöht werden. Das unten beschriebene Verfahren ist auf murine dissoziierte kortikale oder hippokampale Neuronen anwendbar. Die optimalen Zelldichten für andere Neuronentypen können variieren.
- Entfernen Sie den Großteil des Mediums in jeder Vertiefung des Chips, wobei ca. 5 μl in jeder Vertiefung verbleiben. Aspirieren Sie von den Hauptkanälen weg, um zu vermeiden, dass Flüssigkeit aus den Hauptkanälen entfernt wird (Abbildung 1A).
Vorsicht: Saugen Sie keine Flüssigkeit aus den geschlossenen Hauptkanälen an. Luftblasen können im Chip eingeschlossen werden, wenn Flüssigkeit aus den Hauptkanälen angesaugt wird.
- Laden Sie 5 μl Zellsuspension in die obere rechte Vertiefung und weitere 5 μl Zellsuspension in die untere rechte Vertiefung (insgesamt ~120.000 Zellen). Laden Sie die Zellen, indem Sie sie in der Nähe des Hauptkanals dosieren (Abbildung 1B). Überprüfen Sie unter einem Mikroskop, ob sich die Neuronen im Hauptkanal befinden. Warten Sie 5 Minuten, damit sich die Zellen anheften können.
Anmerkung: Neuronen können in beide Kompartimente geladen werden. Zur Erklärung: Das somatische Fach ist der Hauptkanal auf der rechten Seite, aber beide Fächer können als somatisches Fach verwendet werden. Der Einsatz von niedrigeren Zelldichten bis zu 60.000 Zellen pro Chip ist möglich. Bis zu 10 μl Zellsuspension können in Kombination mit einer Zellsuspension mit weniger Zellen als oben beschrieben in jede Vertiefung des somatischen Kompartiments gegeben werden.
- Geben Sie ca. 150 μl neuronale Kulturmedien in jede der oberen und unteren rechten Vertiefungen und fügen Sie dann 150 μl Medien in jede obere und untere linke Vertiefung hinzu. Legen Sie den Chip in die befeuchtete Schale in einem 5 % CO2 37 °C Inkubator.
- Führen Sie nach 24 Stunden einen Medienwechsel durch, indem Sie das Medium aus den Vertiefungen entfernen. Stellen Sie sicher, dass der Hauptkanal gefüllt bleibt. Geben Sie 150 μl Medium in jede obere Vertiefung und füllen Sie dann die unteren Vertiefungen.
- Legen Sie den Chip für die gewünschte Anzahl von Tagen zurück in den Inkubator.
Anmerkung: Überwachen Sie das Medium alle paar Tage, um sicherzustellen, dass es hellrosa bleibt. Wenn das Medium gelblich ist, ersetzen Sie es zu 50 % durch frisches Medium. Wenn der Flüssigkeitsstand niedrig ist, sorgen Sie für eine ausreichende Luftfeuchtigkeit und eine angemessene sekundäre Eindämmung der Späne, um eine Verdunstung zu verhindern. Die Minimierung oder Eliminierung von Medienwechseln ist möglich, indem ein sekundäres Containment und/oder die Schale mit dem Chip mit einer Polytetrafluorethylen (PTFE)-FEP-Folie abgedeckt wird.
