Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Lösungen für Experimente vorbereiten
- Bereiten Sie die Beschichtungslösung für die extrazelluläre Matrix (ECM) vor (siehe Materialtabelle): Tauen Sie die ECM-Mischung auf Eis auf. Die EZM-Mischung 1:10 in basischem Nährmedium (ohne neurotrophe Faktoren oder fetales Rinderserum (FBS)) verdünnen und auf Eis lagern.
- Bereiten Sie das Kulturmedium vor (siehe Materialtabelle): Bereiten Sie einen Vorrat an neurobasalem Medium vor, das weder FBS noch den vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF) enthält. Ergänzen Sie die neurobasalen Medien mit frischem FBS (10%) und BDNF (5 ng/ml), bevor Sie sie der Zellkultur hinzufügen.
- Bereiten Sie die extrazelluläre Lösung vor (siehe Materialtabelle).
>2. Waschen und Sterilisieren von MEAs
HINWEIS: Die für die Experimente verwendeten MEAs enthalten 68 Elektroden, die in einem rechteckigen Gitter angeordnet sind (Abbildung 1E). Jede Elektrode hat eine Größe von 40 x 40μm 2 mit einem Abstand von 200 μm von Zentrum zu Zentrum. Die Elektroden bestehen aus Platin. Die Elektroden sind durch eine Schaltung aus Indiumzinnoxid mit den entsprechenden Kontakten verbunden. Dieser Kreislauf ist durch eine 5 μm dicke Schicht aus SU-8 isoliert. Weitere Informationen zum Anbieter finden Sie in der Materialtabelle. Andere MEA-Layouts können für diese Experimente geeignet sein.
- Für neue MEAs: Spülen Sie sie, indem Sie sie 30 Sekunden lang in 70%iges Ethanol eintauchen und 30 Sekunden lang mit destilliertem Wasser waschen. Arbeiten Sie in einer Laminar-Flow-Haube.
- Lassen Sie die MEA 30 min in einer Laminar-Flow-Haube trocknen.
- Legen Sie jedes MEA in eine sterile Petrischale (35 mm x 10 mm) und verschließen Sie es mit Folie. Die MEAs können bis zur Verwendung gelagert werden.
- Für gebrauchte MEAs: Inkubieren Sie die MEAs in einer Petrischale (35 mm x 10 mm) mit 1 ml enzymatischer Lösung (siehe Materialtabelle) O/N auf einem Orbitalschüttler bei RT, um biologisches Material zu entfernen. Fahren Sie dann fort wie in Schritt 2.1.
Anmerkung: Behandeln Sie die MEAs vorsichtig mit einer Pinzette mit gummiüberzogenen Spitzen.
>3. Vorbereitung von MEAs für Kulturexperimente
- Entfernen Sie die Siegelfolie und lassen Sie das MEA für das gesamte Experiment in der Petrischale (35 mm x 10 mm).
- Die MEA werden mit der in Nummer 1.1 hergestellten Lösung bestreicht: Mit einer kalten 200-μl-Pipettenspitze (bei -20 °C gelagert) werden 50 μl Beschichtungslösung auf jede MEA pipetiert, wobei der gesamte Elektrodenbereich bedeckt ist.
- Lassen Sie MEAs 30 Minuten bis 1 Stunde bei RT beschichten.
- Entfernen Sie die Beschichtungslösung mit einer Pipette. Tragen Sie 100 μl Kulturmedium auf, das mit 10 % FBS und 5 ng/ml BDNF angereichert ist, und belassen Sie es bei RT, bis das Gewebe plattiert ist.
- 2 Petrischalen mit den beschichteten MEAs in eine große Petrischale (94 mm x 16 mm) geben und eine dritte kleine Petrischale mit 1,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zur Befeuchtung hinzufügen.
Anmerkung: Die Zugabe einer kleinen Petrischale (Schritt 3.5), die PBS enthält, ist entscheidend, um die Verdunstung des Kulturmediums deutlich zu minimieren.
>4. Spiralganglion-Dissektion
HINWEIS: Die grobe Dissektion kann außerhalb der Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden (Schritt 4.1 bis 4.4). Für die Feindissektion sind sterile Bedingungen (Laminar-Flow-Haube) zwingend erforderlich (ab Schritt 4.5).
- Tiere (5-7 Tage alte Mäuse) durch Enthauptung ohne vorherige Betäubung einschläfern.
- Sterilisieren Sie den Kopf, indem Sie ihn mit 70% Ethanol besprühen.
- Indem Sie den Kopf festhalten, schneiden Sie die Verbindung zwischen Haut und Schädel mit einer scharfen/scharfen Schere entlang der sagittalen Linie durch.
- Schneide den Schädel sagittal und entferne das Gehirn mit einer scharfen/stumpfen Schere.
- Schneiden Sie die Schläfenknochen aus dem Schädel ab und legen Sie sie in eine Petrischale, die sterile, eiskalte Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) enthält.
- Präparieren Sie mit einem Präpariermikroskop die Paukenblase mit einer feinen Pinzette und isolieren Sie das Innenohr
.
- Entfernen Sie den Knochen der Cochlea mit einer feinen Pinzette.
- Entfernen Sie das Spiralband und die Stria vascularis (SV) zusammen, indem Sie den basalen Teil des Ganglions spirale (SG) und das SV mit einer Zange festhalten und das SV langsam von der Basis bis zur Spitze abwickeln
- Isolieren Sie das Corti-Organ (OC), das SG und den Modiolus (Abbildung 1A-C).
- Trennen Sie das OC von dem SG und dem Modiolus, indem Sie mit einer Pinzette den basalen Teil des SG und des OC halten und das OC langsam von der Basis bis zum Scheitel abwickeln.
- Schneiden Sie mit einer Pinzette und einem Mikroskalpell laterale Explantate (200 bis 500 μm Durchmesser) aus dem Spiralganglion, das noch am Modiolus befestigt ist (Abbildung 1D).
>5. Explantatkultur von Spiralganglien auf MEAs
- Platzieren Sie zwei Spiralganglien-Explantate neben den Elektroden auf dem MEA, das zuvor mit 100 μl Kulturmedium vorbereitet wurde.
- Platzieren Sie das Corti-Organ etwa 5 mm vom Elektrodenbereich entfernt.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Explantate und das Corti-Organ auf das MEA zu pinnen, ohne das Gewebe zu beschädigen.
- Legen Sie die MEAs vorsichtig in den Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 °C und 5 % CO2. Überprüfen Sie am nächsten Tag visuell, ob sich die Explantate an die MEA angeheftet haben.
Anmerkung: Wenn die Explantate kein O/N angeheftet haben, werden sie dies in den nächsten Tagen nur selten tun. Das OC wird zur trophischen/neurotrophen Unterstützung neben der Kultur platziert.
- 100 μl Kulturmedium mit 10 % FBS und BDNF werden täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen zugegeben.
- An Tag 6 werden 2 ml Kulturmedium mit 10 % FBS und 5 ng/ml BDNF zugegeben und das Gewebe weitere 13 Tage lang kultiviert.
