>1. Aussaat von Astrozyten für die Reprogrammierung
HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen unter einer biologischen Sicherheitswerkbank mit Sicherheitsstufe 1 (SL1) durchgeführt werden.
- Bereiten Sie 24-Well-Platten mit Poly-D-Lysin-beschichteten Glasdeckgläsern auf die gleiche Weise vor, wie zuvor Kulturflaschen hergestellt wurden. Um die Anzahl der benötigten Platten zu bestimmen, ist zu berücksichtigen, dass Astrozyten mit einer Dichte von 5-5,5 x 104 Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte plattiert werden. Normalerweise ergibt die Isolierung von sechs Rückenmark von Mäusen am postnatalen Tag 2 (P2) etwa 1 x 106 Zellen.
- Das Medium aus den T25-Kulturflaschen, die die kultivierten Astrozyten enthalten, aspirieren und einmal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen. Die Astrozyten werden durch Zugabe von 0,5 ml 0,05 % Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) aus dem Kulturkolben gelöst und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Klopfen Sie vorsichtig auf die Seite des Kolbens, um Zellen von der Oberfläche des Kulturkolbens freizusetzen, und überprüfen Sie die Ablösung unter einem Hellfeldmikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung.
- Stoppen Sie die Trypsinisierung mit 2,5 ml Astrozyten-Kulturmedium und sammeln Sie die Zellsuspension in 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 300 x g, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Astrozytenkulturmedium. Berechnen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzählsystem.
- Basierend auf der Anzahl der Zellen verdünnen Sie die Zellsuspension mit frischem Astrozytenmedium, um eine Lösung von 1-1,1 x 105 Zellen pro ml zu erhalten. Ergänzen Sie das Medium mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) in einer Dosierung von 10 ng/ml pro Faktor. Geben Sie 500 μl Zellsuspension, entsprechend 5-5,5 x 104 Zellen, in jede Vertiefung der zuvor vorbereiteten 24-Well-Platten und kultivieren Sie Zellen bei 37 °C und 5 % CO2.
>2. Erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren
HINWEIS: Bevor Sie mit dem Protokoll fortfahren, ist es wichtig, das Experiment richtig zu planen. Insbesondere ist es wichtig, immer eine Negativkontrolle für die Reprogrammierung einzubauen, nämlich eine Bedingung, in der kein Reprogrammierungsfaktor exprimiert wird. Wenn beispielsweise Vektoren verwendet werden, die die cDNA für den Reprogrammierungsfaktor und einen Reporter tragen (z. B. grün fluoreszierendes Protein (GFP), DsRed), wird die Negativkontrolle durch denselben Vektor dargestellt, der nur den Reporter trägt. Bei der Expression mehrerer Faktoren, die unterschiedliche Reporter tragen, sollte die Negativkontrolle entsprechend angepasst werden.
Überprüfen - Sie am Tag nach dem Plattieren die 24-Well-Platten, um sicherzustellen, dass die Zellen an den Deckgläsern haften.
- Basierend auf dem experimentellen Ziel und den verfügbaren Ressourcen kann die forcierte Expression von Reprogrammierungsfaktoren durch virale Transduktion (siehe Schritt 2.3) oder DNA-Transfektion (siehe Schritt 2.4) erreicht werden.
HINWEIS: Die Verwendung von Retroviren oder Lentiviren bedarf der Genehmigung der staatlichen Behörden und muss unter einer biologischen Sicherheitswerkbank in einem Labor der Sicherheitsstufe 2 (SL2) durchgeführt werden.
- Programmieren Sie die Astrozyten neu, indem Sie die Zellen mit dem Retrovirus oder Lentivirus transduzieren, das die genetische Information trägt, um den/die Reprogrammierungsfaktor(en) von Interesse zu exprimieren, wie unten beschrieben.
- Zellen mit einem hohen Virustiter von 1 x 1010-1 x10 12 Partikeln/ml werden transduziert, indem 1 μl der Zellsuspension direkt in das Astrozytenmedium gegeben wird. Das sorgt für eine hohe Infektionsrate. Die Zellen werden mit dem Astrozytenmedium, das Viruspartikel enthält, bei 37 °C für 24-36 h kultiviert, bevor je nach Zweck des Versuchs mit Abschnitt 3 fortgefahren wird.
HINWEIS: Verschiedene Promotoren können verwendet werden, um die Expression der Transgene zu steuern (siehe auch Repräsentative Ergebnisse). Konstitutive Promotoren {z. B. Cytomegalievirus (CMV), Huhn β-Aktin (CAG)} induzieren die Expression des Transgens früher als induzierbare Promotoren; Beide Arten von Promotortypen wurden jedoch erfolgreich verwendet, um Zellen in Neuronen umzuprogrammieren.
- DNA-Plasmide können auch durch DNA-Transfektion in Astrozyten eingebracht werden, wie unten beschrieben.
Anmerkung: Dies kann unter einer für SL1 zugelassenen biologischen Sicherheitswerkbank erfolgen.
- Vor der Transfektion ist das Transfektionsreagenz, eine Plasmid-DNA der gewünschten Konstrukte, frisches Astrozytenmedium und serumreduziertes Medium zu beschaffen (siehe Materialtabelle). Berechnen Sie die erforderliche Menge an serumreduziertem Medium (siehe Materialtabelle), wobei zu berücksichtigen ist, dass jede Vertiefung einer 24-Well-Platte 300 μl serumreduziertes Medium benötigt. Geben Sie die entsprechende Menge serumreduziertes Medium in ein 50-ml-Röhrchen und erwärmen Sie es auf 37 °C.
- Wenn das serumreduzierte Medium warm ist, aspirieren Sie Astrozytenmedium aus allen Vertiefungen und sammeln Sie es in einem 50-ml-Röhrchen. Filtrieren Sie das gesammelte Astrozytenmedium mit einem 0,45 μM Spritzenfilter, um abgelöste Zellen zu entfernen.
- Geben Sie dem gefilterten Medium das gleiche Volumen frisches Astrozytenmedium zu, um eine Lösung zu erhalten, die ausreicht, um 1 ml Astrozytenmedium pro Vertiefung hinzuzufügen. Das mit Astrozyten konditionierte Medium wird bis zur Verwendung (Schritt 2.4.9) im Inkubator auf 37 °C gehalten.
Anmerkung: Das Nährmedium wird wiederverwendet, da es mehrere sezernierte Faktoren enthält, die die Lebensfähigkeit der Kultur unterstützen.
- Geben Sie 300 μl vorgewärmtes serumreduziertes Medium in jede Vertiefung und setzen Sie die 24-Well-Platte wieder in den Inkubator ein.
- Bereiten Sie Lösung A vor, bestehend aus DNA und serumreduziertem Medium. Verwenden Sie für jede Vertiefung insgesamt 0,6 μg DNA und geben Sie sie zu 50 μl serumreduziertem Medium. Lösung A bis zur Verwendung bei Raumtemperatur lagern.
HINWEIS: In der Regel wird ein technisches Tripel pro Bedingung in Betracht gezogen. Daher wird eine Mischung hergestellt, die für eine 3,5-Reaktion ausreicht (z. B. 2,1 μg Gesamt-DNA, verdünnt in 175 μl serumreduziertem Medium), um sicherzustellen, dass genügend Material für die Transfizierung von drei Vertiefungen einer 24-Well-Platte vorhanden ist.
- Bereiten Sie Lösung B vor, bestehend aus dem Transfektionsreagenz und dem serumreduzierten Medium. Geben Sie für jede Vertiefung 0,75 μl Transfektionsreagenz in 50 μl serumreduziertes Medium. Da diese Lösung für alle Transfektionszustände gilt, bereiten Sie sie in großen Mengen vor, um die Variabilität zwischen den Transfektionen zu reduzieren.
- Lösung B 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Lösung B tropfenweise im Verhältnis 1:1 zu Lösung A geben und vorsichtig mischen. Nicht wirbeln. Lösung A+B 20-30 min bei Raumtemperatur unter der Haube inkubieren.
- Die Schritte 2.4.5 bis 2.4.7 sind für alle Transfektionsbedingungen zu wiederholen. Nach 20-30 Minuten geben Sie die Lösung A+B Tropfen für Tropfen in jede Vertiefung, um ein Endvolumen von 100 μl zu erhalten. Schütteln Sie die Platte vorsichtig und legen Sie die Zellen wieder für 4 h bei 37 °C in den Inkubator.
- Nach 4 Stunden wird das Transfektionsmedium entfernt und 1 ml des in Schritt 2.4.3 hergestellten, vorgewärmten Astrozyten-konditionierten Mediums zugegeben. Halten Sie die Zellen je nach Zweck des Experiments 36-48 Stunden lang aufrecht, bevor Sie mit Abschnitt 3 fortfahren.
>3. Reprogrammierung von Astrozyten (7-Tage-Analyse)
- Bereiten Sie das neuronale Differenzierungsmedium vor, indem Sie 1 mL B27-Supplement zu 49 mL Basiskulturmedium hinzufügen. Nach 24-48 Stunden, je nachdem, ob die Zellen transduziert oder transfiziert wurden (siehe Schritte 2.3 bzw. 2.4), ersetzen Sie das Astrozytenmedium durch 1 ml neuronales Differenzierungsmedium pro Vertiefung und kultivieren Sie Zellen bei 37 °C und 9 % CO2,
HINWEIS: Die Zellen können auch bei 5 % CO2 gehalten werden, wenn kein 9 % CO2 -Inkubator verfügbar ist. Die neuronale Reprogrammierung ist unter diesen Bedingungen jedoch effizienter.
- Optional: Um die Reprogrammierungseffizienz zu erhöhen, ergänzen Sie das neuronale Differenzierungsmedium mit Forskolin (Endkonzentration von 30 μM) und Dorsomorphin (Endkonzentration von 1 μM), wenn Sie das Astrozytenmedium durch das Differenzierungsmedium ersetzen. Wenn Sie sich für die Behandlung von Zellen mit Forskolin und Dorsomorphin entscheiden, geben Sie 2 Tage nach der Erstbehandlung eine zweite Dosis Dorsomorphin. Geben Sie diese zweite Behandlung direkt auf das Kulturmedium.
Die - direkte Reprogrammierung von murinen Astrozyten in neuronale Zellen erfolgt in der Regel innerhalb von 7 Tagen nach dem Wechsel des Mediums (Abbildung 1). Daher fixieren oder sammeln Sie 7 Tage nach Beginn der neuronalen Reprogrammierung Zellen für die nachgelagerte Analyse.
