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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Entnahme des Gehirns mit intakter Hörnervenwurzel zur Stimulation
HINWEIS: Mäuse für diese Experimente wurden durch Kreuzung von ChAT-IRES-Cre transgenen Mäusen auf einem C57BL/6J-Hintergrund mit tdTomato-Reportermäusen (Ai14) gewonnen. Mäuse, die für die Histologie und Elektrophysiologie verwendet wurden, waren nach dem Hörbeginn (P14-P23), was bei Mäusen etwa P12 entspricht. Neuronen, die tdTomato im ventralen Kern des Trapezkörpers exprimieren (VNTB), wurden in dieser Mauslinie zuvor als mediale Olivochochleare (MOC) Neuronen charakterisiert.
- Einschläfern (z. B. CO2 -Erstickung) und Enthauptung des Tieres mit anerkannten institutionellen Verfahren.
- Schneide mit einer Rasierklinge die Haut an der Mittellinie des Schädels von der Nase bis zum Nacken ein. Ziehe die Haut zurück, um den Schädel freizulegen.
- Machen Sie mit einer kleinen Schere einen Schnitt in den Schädel durch die Mittellinie, beginnend an der Basis (kaudales Ende in der Nähe des Rückenmarks) des Schädels und weiter in Richtung Nase.
- Machen Sie an der Lambda-Naht Schnitte in den Schädel von der Mittellinie seitlich zum Ohr auf beiden Seiten. Schälen Sie den Schädel zurück, um das Gehirn freizulegen.
- Beginnen Sie am rostralen Ende und heben Sie das Gehirn vorsichtig mit einem kleinen Laborspatel oder einer stumpfen Pinzette vom Schädel weg. Schneiden Sie den Sehnerv ab und arbeiten Sie das Gehirn sanft nach hinten, wobei die Bauchfläche freigelegt wird.
- Die Trigeminusnerven werden durchtrennt, indem man sie mit einer feinen Pinzette in der Nähe der ventralen Oberfläche des Hirnstamms einklemmt.
Anmerkung: Tun Sie dies vorsichtig, da der Nervus vestibulocochlears direkt darunter liegt und für eine eventuelle Stimulation intakt sein muss.
- Geben Sie die Zubereitung in eine mit kalter Schnittlösung gefüllte Petrischale aus Glas. Stellen Sie die Schale unter ein Präpariermikroskop. Vorsichtig mit Carbogen sprudeln.
- Den Nervus facialis in der Nähe des Hirnstamms beschneiden und den Nervus vestibulocochlearis freilegen.
- Schieben Sie mit einer feinen Pinzette die Spitzen so weit wie möglich in die Foramina, wo der Nervus vestibulocochlearis aus dem Schädel austritt, und kneifen Sie den Nerv ein, um ihn zu durchtrennen, so dass die Nervenwurzel am Hirnstamm befestigt bleibt. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite.
- Sobald beide Nervenwurzeln frei sind, entfernen Sie die Hirnhäute und das Gefäßsystem von der ventralen Oberfläche des Hirnstamms in der Nähe des Trapezkörpers.
- Befreien Sie das Gehirn vollständig vom Schädel, indem Sie die verbleibenden Hirnnerven und das Bindegewebe einklemmen und darauf achten, dass das verbleibende Rückenmark nach Möglichkeit erhalten bleibt.
>2. Gehirn auf der Bühne blockieren und montieren (magnetische Scheibe)
- Bereiten Sie die Oberfläche des Gehirns darauf vor, sich an der Bühne zu fixieren, indem Sie das Gehirn auf Höhe des Chiasma opticus blockieren.
- Stabilisieren Sie das Gehirn mit der Bauchfläche nach oben mit einem stumpfen Werkzeug, um das Rückenmark sanft zu immobilisieren, damit das Gehirn während des folgenden Schritts nicht kippt.
- Verwenden Sie auf der Höhe des Chiasmas opticum eine offene Pinzette, um die Ebene für die Blockierung des Gehirns zu schaffen, indem Sie durch das Gehirn bis zum Boden der Schale einführen. Führen Sie die Pinzette in einem Winkel von ca. 20° zur Vertikalen ein, so dass die Spitzen von der dorsalen Oberfläche des Gehirns kaudal zum Chiasma opticus austreten.
- Schneide mit der Rasierklinge an der Pinzette entlang.
- Klebe das Gehirn auf die Oberfläche der Bühne.
- Bereiten Sie einen kleinen Block (~1 cm3) 4% Agar zur Unterstützung des Gehirns vor.
- Geben Sie einen kleinen Tropfen Kleber auf die Bühne und verteilen Sie ihn in einem Rechteck, damit sowohl das Gehirn als auch der Agarblock verklebt werden können.
- Heben Sie das Gehirn vorsichtig mit einer Pinzette an und tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig mit dem Rand eines Papiertuchs ab. Lege die blockierte Oberfläche auf den Kleber, die Bauchfläche zeigt während des Schneidens zur Klinge.
- Schieben Sie den Agarblock sanft gegen die dorsale Oberfläche des Gehirns, um ihn beim Schneiden zu stützen und die richtige Positionierung des Gehirns (d. h. den Winkel) zu gewährleisten.
>3. Gehirn schneiden, um eine Keilscheibe zu erstellen
HINWEIS: Bereiten Sie einen Gehirnschnitt mit einem Vibratom vor, das die Cochlea-Nervenwurzel auf der dicken Seite und mediale Olivocochlear (MOC)-Neuronen und den medialen Kern des Trapezkörpers (MNTB) auf der dünnen Seite hat.
- Legen Sie die Magnetscheibe mit dem daran befestigten Gehirn auf den Bühnenfuß und legen Sie sie in die Schneidekammer, wobei die Bauchfläche des Gehirns zur Klinge hin ausgerichtet ist.
- Die Kammer mit eiskalter Schnittlösung füllen und mit Carbogen besprühen.
- Senken Sie die Klinge in die Lösung und schneiden Sie die Scheiben kaudal in den interessierenden Bereich, um sicherzustellen, dass die Scheiben symmetrisch sind. Wenn die Scheiben asymmetrisch erscheinen, neigen Sie den Tisch leicht, um die Symmetrie zu erhalten.
Anmerkung: Klingengeschwindigkeiten zwischen 0,05 und 0,10 mm/s waren effektiv für das Schneiden gesunder Scheiben und können je nach Alter und Gehirnregion des Tieres variieren.
- Sobald die Scheiben symmetrisch sind, verschieben Sie den Tisch um ~15° (entspricht ca. 3 konzentrischen Ringen auf dem Tischfuß) zur Seite.
Anmerkung: Verschiebe die Bühne weg von der Hörnervenwurzel, die du in der Scheibe erhalten möchtest.
- Fahren Sie mit dem vorsichtigen Schneiden fort, bis die Hörnervenwurzel auf einer Seite nahe an der Oberfläche ist und der Gesichtsnerv an der Oberfläche der anderen Seite zu sehen ist.
- Verschieben Sie den Tisch um 15° zurück in die ursprüngliche Position.
- Bewegen Sie die Klinge vom Gewebe weg und drehen Sie die Tischbasis um 90°, so dass die seitliche Kante der dünnen Seite zur Klinge zeigt. Senken Sie die Klinge einige hundert Mikrometer ab und bringen Sie die Klinge dann langsam nahe an den Rand des Gewebes. Wiederholen Sie dies, bis die Klinge die Seitenkante berührt. Senken Sie die Klinge auf die gewünschte Dicke des dünnen Randes der Scheibe ab, hier zusätzlich zweihundert Mikrometer.
Anmerkung: Die resultierende Scheibe ist idealerweise ~300 mm dick auf Höhe des ventralen Kerns des Trapezkörpers (VNTB) auf der Seite, an der die Patch-Klemmung stattfinden wird.
- Bewegen Sie die Klinge zurück vom Gewebe und drehen Sie die Bühnenbasis zurück, so dass die Bauchfläche ihr zugewandt ist.
- Machen Sie den Schnitt, der die rostrale Oberfläche der Keilscheibe kennzeichnet. Übertragen Sie die Scheibe mit der Schwanzfläche nach unten auf ein Blatt Trennpapier (1 cm2). Die Scheibe zur Gewinnung in die Inkubationskammer oder ein anderes geeignetes Inkubationsgerät bringen (30 min bei 35 °C).
Anmerkung: Der Nervus facialis sollte auf beiden Hemisphären des Schnitts auf der rostralen Oberfläche sichtbar sein (siehe Abbildung 1B).
