Stimulierung der neuronalen Zelldifferenzierung mit Gold-Nanostäbchen

Zusammenfassung

Quelle: Paviolo., et al. Gold-Nanostäbchen-unterstützte optische Stimulation von neuronalen Zellen. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Förderung der neuronalen Differenzierung, indem Nervenzellen Gold-Nanostäbchen und Laserlicht ausgesetzt werden, das Zellprojektionen bildet, die vom βIII-Tubulin unterstützt werden. Die Färbung und Beobachtung von Tubulin und des Zellkerns mit der Epifluoreszenzmikroskopie zeigt die Auswüchse der Zellen, was auf die Wirksamkeit der Nanostäbchen bei der neuronalen Differenzierung hinweist.

Protokoll

>1. NG108-15 Neuronale Zelllinienkultur und Differenzierung

1. Bereiten Sie für das Zellkulturmedium 500 ml steriles Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) vor, das 10 % (w/v) fötales Kälberserum (FCS), 1 % (w/v) L-Glutamin, 1 % (w/v) Penicillin/Streptomycin und 0,5 % (w/v) Amphotericin B.
   Hinweis: Nahrungsergänzungsmittel können aliquotiert, bei -20 °C gelagert und am gewünschten Tag auf das Medium gegeben werden. Das Zellkulturmedium kann in sterilem Zustand maximal 1 Monat lang gekühlt werden.
2. Bereiten Sie für das Zelldifferenzierungsmedium 50 ml steriles DMEM vor, das 1 % (w/v) L-Glutamin, 1 % (w/v) Penicillin/Streptomycin und 0,5 % (w/v) Amphotericin B enthält.
3. NG108-15 neuronale Zellen in 10 ml Zellkulturmedium in T75-Kolben aus Polystyrol in einem Inkubator mit befeuchteter Atmosphäre (5% CO2 bei 37 °C) züchten. Normalerweise säen Sie 1,5-2 × 10⁵ Zellen in jedem Kolben, um in 3-4 Tagen fertig zu sein. Wechseln Sie das Zellkulturmedium alle zwei Tage.
   Hinweis: Um genetische Drifts oder Variationen zu vermeiden, verwenden Sie für Experimente keine Zellen, die älter als Passage 21 sind.
4. Wenn 70-80 % in der Kultur zusammenfließen, wechseln Sie das Medium durch ein warmes, frisches Zellkulturmedium. Die Zellen werden mechanisch gelöst, indem man vorsichtig auf den Boden des Konfluentkolbens klopft. Verwenden Sie kein Trypsin.
5. Die Zellsuspension wird 5 min lang bei 600 x g zentrifugiert und das Zellpellet in 2 ml warmem Zelldifferenzierungsmedium resuspendiert.
6. Saatgut 2 × 10⁴ Zellen/cm² in einer Gewebekulturplatte aus Polystyrol 96 mit 200 μl Zelldifferenzierungsmedium. Inkubieren Sie das Experiment 1 Tag lang bei 5% CO2 / 37 °C.
7. An Tag 2 zwischen 3,2 × 10⁹ - 4,2 ×^{10 10} Partikel/ml Gold-Nanostäbchen-Lösung (Au NR) zugeben und weitere 24 Stunden inkubieren. Fügen Sie die Partikel für die Kontrollexperimente nicht hinzu.
   Hinweis: Als alternative Kontrolle können Goldnanopartikel (Au NPs) mit einer gut differenzierten Peak-Absorptionswellenlänge zu Vergleichszwecken verwendet werden. Für ein konsistenteres Zellverhalten halten Sie die Zelldichte konstant und verändern Sie die Well-Oberfläche nicht vor der Aussaat der Zelle.

>2. Verbesserung des Neuritenauswuchses

1. Koppeln Sie den Laser mit einer Singlemode-Glasfaser (numerische Apertur = 0,13) und schließen Sie ihn mit einem Faserstecker ab (FC-Steckverbinder sind praktisch und allgemein verfügbar). Messen Sie die Ausgangsleistung des Lasers mit einem Standard-Leistungsmesser. Um die effektivsten Ergebnisse zu erzielen, passen Sie die Peakwellenlänge des Lasers an den Plasmonenresonanzpeak der NRs an.
2. Befestigen Sie am Tag 3 nach der NR-Inkubation den FC-Anschluss an der Vertiefung. Bestrahlen Sie Proben und Kontrollen bei RT für 1 min in kontinuierlicher Welle für unterschiedliche Laserleistungen. Lassen Sie die Kultur weitere 3 Tage bei 5 % CO2 / 37 °C weitergehen. Wiederholen Sie die Laserbestrahlung für mindestens 3 unabhängige Messungen.
   Hinweis: Je nach Anwendung können unterschiedliche Bestrahlungszeiten und Impulsfrequenzen gewählt werden.
3. Charakterisieren Sie den Laser in Bezug auf den Strahldurchmesser und die Laserbestrahlungsstärke (W∙cm-2).
   1. Für eine Standard-Singlemode-Faser verwenden Sie NA = n∙sinθ, wobei n der Brechungsindex des verwendeten Mediums und θ der Halbwinkel des Lichtkegels ist, der aus der Faser austritt (siehe Abbildung 1A). Aus der Trigonometrie ergibt sich r = tanθ∙d, wobei r der Strahlradius und d der Abstand zwischen der Faser und der Probe ist. Der FC-Anschluss passt sich dem Durchmesser der Vertiefung an und beleuchtet daher die Probe in einem Abstand von d = 2,70 ± 0,20 mm. Licht verlässt die Faser in Wasser (n = 1,33), was r = tan(sin-1(NA/n))∙d ergibt.
   2. Berechnen Sie mit der letztgenannten Gleichung den Laserstrahlradius, die entsprechende Strahlfläche und die durchschnittliche Laserbestrahlungsstärke (Laserleistung dividiert durch Strahlfläche) am Ziel (siehe Beispielgrafik in Abbildung 1B). Diese Werte stellen die durchschnittliche Bestrahlungsstärke über die beleuchtete Fläche dar.
   3. Bewerten Sie die Fehler für die Messungen mit der allgemeinen Theorie der Fehlerausbreitung.
      Hinweis: Der Abstand zwischen dem FC-Anschluss und der Probe kann durch Fotografien des Versuchsanordnungs und der Nachbearbeitung des Bildes mit geeigneter Software (z. B. ImageJ) gemessen werden.
4. An Tag 5 wird das Zelldifferenzierungsmedium aus den Experimenten entfernt und die Proben 10 min lang mit 3,7 % (v/v) Formaldehydlösung fixiert, dann werden die Zellen 20 min lang mit 0,1 % (v/v) Triton X-100 permeabilisiert.
5. Geben Sie 3 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) für 60 Minuten zu den Proben, um die nicht umgesetzten Proteinbindungsstellen zu blockieren. Die Proben über Nacht (5 μg/ml in PBS, ergänzt mit 1 % BSA) auf Anti-βIII-Tubulin markieren, werden bei 4 °C markiert.
6. Inkubieren Sie die Zellen 90 Minuten lang im Dunkeln mit einem geeigneten Sekundärantikörper (z. B. TRITC (Tetramethylrhodamin)-konjugierter Anti-Maus-IgG-Antikörper) mit einer Konzentration von 0,4-2 μg/ml in 1% BSA in PBS. Markieren Sie die Zellkerne mit DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol) (0,1 μg/ml in entionisiertem Wasser) für 10 min.
   Hinweis: Die Konjugation und Konzentration von Antikörpern kann je nach Unternehmensprotokoll variieren. Waschen Sie die Proben nach jeder Färbephase zweimal 5 Minuten lang mit PBS.
7. Bildgebung von Proben durch Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskopie mit mindestens einem 20×Objektiv. Wählen Sie die Mikroskopfilter entsprechend dem Sekundärantikörper. Wählen Sie einen DAPI-Filter (λEX = 358 nm; λEM = 488 nm), um die Zellkerne sichtbar zu machen.
8. Analysieren Sie die Bilder, indem Sie Folgendes bewerten: i) die maximale Neuritenlänge (notieren Sie die Länge von der Spitze des Neuriten bis zum Anfang des Zellkörpers), ii) die Anzahl der Neuriten pro neuronaler Zelle (addieren Sie alle Neuriten pro Zelle) und iii) den Prozentsatz der Zellen mit Neuriten (dividieren Sie die Gesamtzahl der Zellen, die βIII-Tubulin exprimieren, durch die Gesamtzahl der Zellen mit einem positiv gefärbten Zellkern)

Ergebnisse

Abbildung 1. Der Versuchsaufbau (A) der optischen Faser und die durchschnittlichen Laserbestrahlungsstärken als Funktion der Laserleistung für einen Laserstrahl mit einer Fläche von 0,4 mm2 (B) betragen. Die Strahlparameter sind (A): der Halbwinkel des maximalen Lichtkegels, der aus der Faser austritt (θ), der Strahlradius (r) und der Abstand zwischen der optischen Faser und der Probe (d).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Au NR	Sigma Aldrich	716812
Nr. NG108-15	Sigma Aldrich	8811230
DMEM	Sigma Aldrich	Nr. D6546
Fcs	Lebenstechnologien	10100147
L-Glutamin	Sigma Aldrich	Nr. G7513
Penicillin/Streptomycin	Lebenstechnologien	15140122
Amphotericin B	Lebenstechnologien	15290018
Formaldehyd	Sigma Aldrich	Nr. F8775
Triton X-100	BDH	Nr. T8532
Bsa	Sigma Aldrich	Nr. A2058
Anti-βIII-Tubulin	Promega	Nr. G7121
TRITC-konjugierter Anti-Maus-IgG-Antikörper	Sigma Aldrich	Nr. T5393
DAPI	Invitrogen	Nr. D1306
UV-Vis-Spektrometer	Varian Medical Systems Inc.	Cary 50 Bio
Mini-Zentrifuge	Eppendorf	Mini-Drehung
Schallbad	Unisonics Australien	FPX 10D
Inkubator für Zellkulturen	Kendro	Hera Zelle 150
Zellkultur-Zentrifuge	Hettich	Rotofix 32A
Laserdiode	Optotech	780 nm Singlemode-Faser - gekoppelt LD
Lichtwellenleiter	Thorlabs	780 PS
Leistungsmesser	kohärent	Laser-Check
BildJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
Epifluoreszierendes Mikroskop	Axon Instrumente	ImageX-Presse 5000A
Pbs
Polystyrol 96-Well-Platte
CO2-Ausstoß
T75 Kolben