Erzeugung von primären retinalen Ganglienzellkulturen aus Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

Quelle: Terzi, A., et al., ROS Live Cell Imaging during Neuronal Development. J. Vis. Exp. (2021)

Das Video demonstriert eine Methode zur Kultivierung primärer retinaler Ganglienzellen aus Zebrafischembryonen. Embryonen im Frühstadium werden dissektioniert, um die Augen zu isolieren, die anschließend mechanisch in eine Suspension aus retinalen Ganglienzellen dissoziiert werden. Diese Zellsuspension wird auf Deckgläsern kultiviert, die mit Klebeproteinen beschichtet sind, um die Axonentwicklung zu erleichtern.

Protokoll

>1. Vorbereitung von Lösungen

1. E2 Medien (1x)
   1. Bereiten Sie 100x E2A (500 ml), 500x E2B (100 mL) und 500x E2C (100 mL) Lösungen vor, indem Sie alle in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten kombinieren. Autoklavieren Sie E2A-, E2B- und E2C-Lösungen. Bei 4 °C lagern.
   2. Für 1x E2-Medien: Kombinieren Sie 5 ml 100x E2A, 1 ml 500x E2B und 1 ml 500x E2C. Bringen Sie das Volumen mit sterilem Wasser auf 500 ml. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0-7,5 ein.
   3. Bereiten Sie 50 ml-Aliquots von 1x E2-Medien vor und lagern Sie sie bei -20 °C für die Langzeitlagerung. Beim Auftauen kann es jedoch zu Niederschlägen kommen. Stellen Sie sicher, dass der Niederschlag vollständig aufgelöst ist, bevor Sie die Stammlösung verwenden.

Tabelle 1: Bestandteile von 1x E2-Medien für die Zebrafisch-Zellkultur.

Lösung	Bestandteil	Menge	Konzentration
100X E2A (500 ml)
	NaCl	43,8 Gramm	ca. 1500 mM
	Kcl	ca. 1,88 Gramm	50 mM
	MgSO4	6 g	ca. 100 mM
	KH2PO4	ca. 1,03 Gramm	ca. 15 mM
	Na2HPO4	0,34 Gramm	5 mM
500X E2B (100 ml)
	CaCl2	5,5 g	500 mM
500X E2C (100 ml)
	NaHCO3	3 g	350 mM
1X E2 (500 ml)
	100X E2A	5 mL	1-mal
	500X E2B	1 mL	1-mal
	500X E2C	1 mL	1-mal

2. E3 Medien (1x)
   1. Lösen Sie die Komponenten in 1 l sterilem Wasser auf, wie in Tabelle 2 gezeigt, um das 100-fache Material herzustellen. Verdünnen Sie die Brühe in sterilem Wasser, um 1x E3-Medien herzustellen.
   2. 0,2 % Methylenblau hinzufügen. Für 20 mL 1x E3-Medien fügen Sie 40 μl Methylenblau hinzu.

Tabelle 2: Bestandteile von 100x E3-Medien zur Erhaltung von Zebrafischembryonen.

Uhr kg kg kg

Bestandteil	Menge (g)	Konzentration im 100-fachen Stamm (mM)
NaCl	29,22	500
Kcl	1,26	17
CaCl2 2H2O	4,85	33
MgSO4 7H2Ω	8,13	33

3. 80x Kochsalzlösung
   1. Kombinieren Sie alle in Tabelle 3 aufgeführten Komponenten. Fügen Sie Wasser hinzu, um eine 100-ml-Lösung herzustellen. Mischen, bis sich alle Komponenten aufgelöst haben. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C.

Tabelle 3: Bestandteile von 80x Kochsalzlösung für Zebrafisch-Zellkulturmedien.

kg kg kg

Bestandteil	Menge (g)	Konzentration auf Lager (mM)
Traubenzucker	1,44	80
Natriumpyruvat	0,44	40
CaCl2 2H2O	0,148	10
HEPES	6,1	Nr. 256

4. Zebrafisch-Zellkulturmedium (ZFCM+)
   1. Kombinieren Sie alle in Tabelle 4 aufgeführten Komponenten, um ein 250-ml-Medium herzustellen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,5 ein. Filtern Sie das Medium mit 0,22 μm und lagern Sie es bei 4 °C.

Tabelle 4: Bestandteile des Zebrafisch-Zellkulturmediums mit Serum und Antibiotika.

kg kg kg kg kg kg Uhr

Bestandteil	Menge (mL)	Volumen %
L-15 medium (mit Phenolrot)	212,75	85,1
Fötales Rinderserum (FBS)	5	arabische Ziffer
Penicillin/Streptomycin	1	0,4
80X Kochsalzlösung	3.125	1,25
Wasser	28.125	11.25

>2. Primäre retinale Ganglienzellkultur aus Zebrafischembryonen

HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2.1 und 2.2 in einer Laminar-Flow-Haube aus.

1. Vorbereitung von Deckgläsern
   1. Bereiten Sie in jedem Experiment 4-6 Kulturplatten vor. Verwenden Sie säuregereinigte Deckgläser (22 x 22 mm quadratisch; 0,16-0,19 mm Dicke), die in 100 % Ethanol gelagert werden.
   2. Entfernen Sie ein Deckglas mit einer Pinzette aus dem Vorratsbehälter und flammen Sie es ab, um Ethanolreste zu entfernen.
   3. Trocknen Sie den Deckglas vollständig an der Luft, indem Sie ihn schräg in eine 35-mm-Kulturschale legen.
   4. Bereiten Sie die Arbeitslösung Poly-D-Lysin (PDL) (1x) vor, indem Sie 10x Stamm (5 mg/ml) in sterilem Wasser verdünnen.
   5. Tragen Sie 100 μl 0,5 mg/ml PDL auf die Mitte jedes Deckglases auf und vermeiden Sie ein Ausbreiten der Lösung an den Rändern.
   6. Inkubieren Sie die PDL auf Deckgläsern für 20-30 min bei Raumtemperatur (RT). Achten Sie darauf, dass die PDL nicht austrocknet.
   7. Waschen Sie das PDL dreimal mit 0,5 mL sterilem Wasser. Lassen Sie die Platten vollständig trocknen.
   8. Bereiten Sie die Laminin-Arbeitslösung (1x) vor, indem Sie 50x Stamm (1 mg/ml) in 1x PBS verdünnen.
   9. Tragen Sie 100 μl 20 μg/ml Laminin in PBS auf die Mitte jedes Deckglases auf und vermeiden Sie die Ausbreitung der Lösung an den Rändern.
   10. Die Platten bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator für 2-6 h inkubieren. Vermeiden Sie ein Austrocknen der Lamininlösung.
2. Embryodissektion und Plattierung von RGCs
   1. Bereiten Sie vier 35-mm-Gewebekulturschalen vor und beschriften Sie sie und füllen Sie sie am Tag der Sektion mit 4 ml Ethanol: 70 % Ethanol, "E2 Medium 1", "E2 Medium 2", "E2 Medium 3". Bewahren Sie das Geschirr bis zum Sezieren im Kühlschrank auf.
   2. Wenn die Zebrafischembryonen 34 Stunden nach der Befruchtung (hpf) sind, nehmen Sie die mit Laminin beschichteten Kulturschalen aus dem Inkubator und waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 0,5 ml 1x PBS.
   3. Geben Sie nach dem letzten Waschen 4 ml ZFCM(+)-Medien in jede Kulturschale und vermeiden Sie das Austrocknen der Platte.
   4. Rufen Sie die vorbereiteten Kulturschalen aus Schritt 2.2.1 ab. Lassen Sie sie sich zur RT ausgleichen.
   5. Füllen Sie 4-6 PCR-Röhrchen mit 15 μL ZFCM(+)-Medien. Ein Röhrchen wird benötigt, um RGCs aus 4 Augen vorzubereiten, die auf ein Deckglas aufgebracht werden sollen.
   6. Entnehmen Sie Zebrafischembryonen aus dem Inkubator und tauchen Sie die Embryonen für 5-10 s in eine 35-mm-Gewebekulturschale mit 70 % Ethanol für 5-10 Sekunden, um sie zu sterilisieren.
   7. Übertragen Sie die Embryonen mit einer Transferpipette in eine Schale mit E2-Medium 1, die steriles E2-Medium enthält, um überschüssiges Ethanol zu waschen.
   8. Übertragen Sie die Embryonen in die E2 Media 2 Schale und entfernen Sie ihre Chorionen mit einer scharfen Pinzette.
   9. Übertragen Sie die Embryonen in die endgültige E2 Media 3-Schale, um Dissektionen durchzuführen.
   10. Präpariere die Netzhaut mit einer feinen Pinzette.
   11. Positionieren und halten Sie die Embryonen mit einer der Pinzetten vor ihrem Eigelb und entfernen Sie mit der anderen Pinzette den Schwanz hinter dem Dottersack.
   12. Fassen Sie den Hals mit einer Pinzette und nehmen Sie den Kopf ab, um Gehirn und Augen den E2-Medien auszusetzen. Vermeiden Sie es, den Dottersack zu schneiden.
   13. Rollen Sie mit der Spitze einer feinen Pinzette die Augen vorsichtig vom Kopf weg, während Sie das Schädelgewebe mit der zweiten Pinzette nach unten halten. Halten Sie die Augen von den angrenzenden Geweberesten isoliert.
   14. Übertragen Sie vier Augen auf eines der zuvor vorbereiteten Röhrchen, die ZFCM(+) enthalten.
   15. Titrieren Sie mit der P20-Pipette und einer gelben Spitze etwa 45 Mal vorsichtig auf und ab, um die Zellen zu dissoziieren. Vermeiden Sie Luftblasen.
   16. Übertragen Sie das ZFCM(+) mit dissoziierten Zellen in die Mitte des Deckglases. Wiederholen Sie die Schritte 10-12 für weitere Deckgläser.
   17. Bewahren Sie die Kulturen auf dem Tisch bei 22 °C auf einem Gestell aus Polystyrolschaum auf, um Vibrationen zu absorbieren.
   18. Die Bildgebung 6-24 Stunden nach der Beschichtung durchführen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
35-mm-Kulturschale	Sarstedt	Tel.: 83-3900
Calciumchlorid-Dihydrat	Fisher Scientific	Nr. C79-500
Deckglas	Corning	Nr. 2850-22
Einweg-Petrischalen (100 x 15 mm)	VWR	Artikel-Nr.: 25384-094
Fötales Rinderserum	ThermoFisher Scientific	26140087
Traubenzucker	Sigma Aldich	Nr. G7528
HEPES	Sigma Aldich	Nr. H4034
Laminin	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 23017-015
Leibovitz's L-15 Medium ohne Phenolrot	Gibco/Fisher Scientific	Tel.: 21-083-027
Pbs	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Poly-D-Lysin (PDL)	Sigma Aldich	Nr. 7280
Natriumpyruvat	Sigma Aldich	Nr. P5280
Steritop 0,22 μm Filter	Millipore	S2GPT05RE