Ethische Genehmigungen wurden bei der Durchführung der Experimente eingeholt.
>1. Isolierung von humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNCs)
- Stellen Sie sicher, dass alle Spender vor der Blutentnahme eine Einverständniserklärung in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien unterschrieben haben.
- Entnehmen Sie 30 ml Blut von gesunden Spendern durch geschultes medizinisches Personal gemäß dem Standardprotokoll.
- Isolierung von PBMNCs durch Dichtegradientenmedien. Verwenden Sie 10 ml Medium mit 25 ml 1:1-Blut, verdünnt mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), und zentrifugieren Sie 30 Minuten lang bei 300 x g.
- Isolieren Sie die Interphasenschicht zwischen dem Plasma und dem Dichtegradientenmedium durch Pipettieren. Waschen Sie die isolierten Zellen mit 5 mL sterilem PBS und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 300 x g. Wiederholen Sie dies zweimal.
- Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit Standardmethoden unter Verwendung einer Zählkammer.
>2. Aktivierung von humanem Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-verankertem Glykoprotein durch Antikörpervernetzung auf der Oberfläche von PBMNCs
- Legen Sie die 6 x 106 mononukleären Zellen (MNCs) in 15-ml-Röhrchen und führen Sie eine Antikörpervernetzung durch, indem Sie die Zellen 30 Minuten lang mit humanen GPI-verknüpften Membranprotein-spezifischen Antikörpern (30 μg/ml) in PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) bei 37 °C inkubieren.
- Ersetzen Sie das Inkubationsmedium durch das modifizierte Dulbecco-Medium von Iscove, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird.
- Züchten Sie die Zellen in 15 mL Polystyrolröhrchen, legen Sie die Röhrchen für 8-10 Tage (ohne Schütteln) bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator. Geben Sie an Tag 5 (D5) zusätzlich 1-2 ml Iscove-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, auf jedes 15-ml-Röhrchen.
>3. Sortierung neu erzeugter dedifferenzierter Zellen
- Zählen Sie Zellen mit einem automatisierten Zellzähler (18 μl Zellsuspension + 2 μl Fluoreszenzfarbstoff) oder in einer Zählkammer.
- Die kultivierte Zellsuspension (5-7 x 106) bei 300 x g für 10 min zentrifugieren und den resultierenden Überstand mit einer sterilen Pasteurpipette aspirieren.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 90 μl vorgekühltem PBS pH 7,2, 0,5 % BSA und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).
- CD45-positive magnetische Kügelchen in Nanogröße (80 μl) zur Zellsuspension geben und 15 Minuten auf Eis inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen, indem Sie 2 mL PBS-Puffer hinzufügen und 10 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren.
- Suspendieren Sie die Zellen in 500 μl PBS-Puffer.
- Waschen Sie die Säule mit 500 μl vorgekühltem PBS-Puffer und stellen Sie sie in das Magnetfeld.
- Legen Sie die Zellsuspension auf die Säule und waschen Sie sie mit 500 μl PBS-Puffer (zweimal) und dem Zentrifugenfluss mit CD45-negativen Zellen. Sammle sie im Medium von Iscove, das mit 1 % BSA angereichert ist.
- Zählen Sie die Zellen in der Zählkammer.
>4. Vorbereitung von Zellkulturschalen für die neuronale Differenzierung neu erzeugter Stammzellen
- Beschichten Sie die Kulturgefäße mit Poly-L-Ornithin und Laminin für das Wachstum neuronaler Zellen.
- Legen Sie die Deckgläser in 4-Well-Platten und beschichten Sie sie mit 1:5 verdünntem Poly-L-Ornithin (0,1 mg/mL in doppelt destilliertem Wasser [ddH2O]) in ddH2O. Legen Sie die Deckgläser für 1 h in einen 37 °C Inkubator. Anschließend mit ddH2O waschen.
- Tauen Sie Laminin (0,5-2,0 mg/ml) langsam auf und geben Sie es auf die Oberseite der Deckgläser. Inkubieren Sie es bei 37 °C für 2 h.
- Bereiten Sie das neuronale Induktionsmedium N2 vor, bestehend aus 49 mL des modifizierten Eagle-Mediums/Nährstoffgemisches F-12 (D-MEM/F12) von Dulbecco, 500 μL N2-Supplement, 400 μL nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Lösung (FGF) in einer Endkonzentration von 20 ng/ml (hergestellt aus 100 μg/ml-Stammlösung) und Heparin in einer Endkonzentration von 2 ng/ml.
- Entfernen Sie überschüssiges Laminin durch Pipettieren und geben Sie das neuronale Medium N2 in Kulturschalen.
>5. Kultivierung neuronaler dedifferenzierter Blutzellen
- Aus BD gewonnene CD45-negative Zellen auf laminin/ornithinbeschichteten Glasdeckgläsern für 2 Tage in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 in N2-Medium kultivieren, um eine neuronale Differenzierung von neu BD-generierten Zellen zu initiieren.
- Kultivieren Sie Zellen weiter in neuronalem Differenzierungsmedium, bestehend aus 48 mL neurobasalem Medium, 500 μl L-Glutamin, 1 mL B27 Supplement, 500 μl NEAA, 50 μl rekombinantem humanem glial-abgeleitetem neurotrophem Faktor (GDNF) bei 5 μg/250 μl in PBS/0,1 % BSA und 50 μl rekombinantem humanem hirnabgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF) bei 5 μg/200 μl in PBS/0,1 % BSA und 50 μl μl Ascorbinsäurelösung 2,9 g/50 ml in PBS. Die Platten bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator stellen.
