Wachstum und Differenzierung von magnetischen, mit Nanopartikeln beladenen Neuronen auf magnetischen Plattformen

Zusammenfassung

Quelle: Indech, G., et al. Fabrication of Magnetic Platforms for Micrometer-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt die Aufnahme von fluoreszierenden magnetischen Nanopartikeln (MNPs) durch die neuronalen Zellen mittels Endozytose. Das Wachstum dieser MNP-geladenen Neuronen auf dem magnetisch strukturierten Substrat ermöglicht die Anheftung der Zellen. Die Zugabe eines Wachstumsfaktors, der Medium enthält, unterstützt das Wachstum von Neuronenerweiterungen, während das Magnetfeld des Substrats die Ausrichtung der Erweiterung steuert.

Protokoll

>1. Aufnahme zellulärer magnetischer Nanopartikel (MNP)

1. Bereiten Sie das Basis-Wachstumsmedium für die PC12-Zellkultur vor, indem Sie 10 % Pferdeserum (HS), 5 % fötales Rinderserum (FBS), 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin und 0,2 % Amphotericin in das Medium des Roswell Park Medical Institute (RPMI) geben und mit einem 0,22-μm-Nylonfilter filtrieren.
2. Geben Sie 1 % Pferdeserum (HS), 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin und 0,2 % Amphotericin in das RPMI-Medium, um das PC12-Differenzierungsmedium herzustellen und mit einem 0,22-μm-Nylonfilter zu filtrieren.
3. Züchten Sie die Zellen in einem unbehandelten Kulturkolben mit 10 ml basischem Wachstumsmedium; geben Sie alle 2-3 Tage 10 ml basisches Wachstumsmedium in den Kolben und subkulturieren Sie die Zellen nach 8 Tagen.
4. Für die zelluläre Aufnahme zentrifugieren Sie die Zellsuspension in einem Zentrifugenröhrchen für 8 min bei 200 × g und Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand.
5. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml frischem basischem Wachstumsmedium. Die Zellsuspension wird erneut 5 Minuten lang bei 200 × g und Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand verworfen. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml frischem Differenzierungsmedium.
6. Aspirieren Sie die Zellen 10x mit einer Spritze und einer Nadel, um Zellcluster aufzubrechen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und säen Sie 10⁶ Zellen in einer normalen unbeschichteten 35-mm-Schale.
7. Geben Sie das berechnete Volumen der MNP-Suspension und das Volumen des Differenzierungsmediums in die Schüssel, um die gewünschte MNP-Konzentration und das gewünschte Gesamtvolumen zu erreichen. Mischen Sie die Zellen, MNPs und das Differenzierungsmedium; Die Schale in einem 5 % CO₂ -befeuchteten Inkubator bei 37 °C für 24 h inkubieren.
8. Die Zellsuspension wird 5 Minuten lang bei 200 × g bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand verworfen. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml frischem Differenzierungsmedium und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

2. Zelldifferenzierung und Zellwachstum auf magnetischer Plattform

1. Reinigen Sie das gemusterte Substrat mit 70 % v/v/Ethanol und legen Sie das Substrat in eine 35 mm Kulturschale in der Haube. Platzieren Sie einen großen Magneten (~1500 Oersted) für 1 Minute unter dem gemusterten Substrat und entfernen Sie den Magneten, indem Sie zuerst die Schale nach oben und vom Magneten weg bewegen und dann den Magneten aus der Haube nehmen. Schalten Sie das ultraviolette Licht für 15 Minuten ein.
2. Beschichten Sie das Substrat mit Kollagen Typ 1, indem Sie Kollagen Typ 1 (Lösung aus Rattenschwanz) 1:50 in 30 % v/v Ethanol verdünnen. Um eine 35-mm-Schale zu beschichten, fügen Sie 20 μl Kollagen zu 1 ml 30%igem Ethanol hinzu.
3. Bedecken Sie die Schale mit der Lösung und warten Sie, bis die gesamte Lösung verdampft ist, wobei Sie die Schale einige Stunden lang unbedeckt lassen. 3x in sterilem 1x PBS waschen; Der Objektträger ist bereit für die Zellaussaat.
4. Suspendieren Sie die Zellen nach der zellulären MNP-Aufnahme, säen Sie 10⁵ Zellen in einer 35-mm-Kulturschale aus und fügen Sie 2 ml Differenzierungsmedium hinzu. Inkubieren Sie die Kultur in einem 5 % CO2-befeuchteten Inkubator bei 37 °C.
5. Nach 24 h 1:100 frisches murines β-NGF (Endkonzentration von 50 ng/ml) zugeben. Erneuern Sie das Differenzierungsmedium und fügen Sie alle 2 Tage frisches murines β-NGF hinzu.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6-Well-Zellkulturplatte	Falke	353846
96-Well-Zellkulturplatte	SPL Biowissenschaften	30096
Amphotericin B-Lösung	Biologische Industrien	03-028-1B
Rinderserumalbumin (BSA)	Biologische Industrien	03-010-1B
und Gewebekulturkolben	Biofil	TCF002250	75,0 cm^2 250 mL Entlüftungskappe, unbehandelt
Zellkulturschale	Greiner Bio-One	Nr. 627-160	35 mm
Zentrifugenröhrchen	Biofil	CFT021500	50 mL
Kollagen Typ I	Corning Inc.	354236	Rattenschwanz, Konzentrationsbereich 3-4 mg/ml
Einweg-Nadel	KDL		ca. 23 g
Wegwerfspritze	Medispo	1160227640	10 mL
Spender Pferdeserum	Biologische Industrien	04-124-1A
Ethanol 70%	ROMICAL LTD	Artikel-Nr.: 19-009102-80
Ethanol absolut (dehydriert)	Biolabor-Chemikalien	Artikel-Nr.: 52505
Fötales Rinderserum (FBS)	Biologische Industrien	04-127-1A
Frische murine β-NGF	Peprotech	Nr. 450-34
GMW C-Rahmen Elektromagnet .	Buckley Systeme GmbH		3470, 45 mm
L-Glutamin	Biologische Industrien	03-020-1B
PBS 10x	hylabs	BP507/1LD
PC12-Zelllinie	ATCC	CRL-1721
Penicillin-Streptomycin-Nystatin-Lösung	Biologische Industrien	03-032-1B
RPMI 1640 mit L-Glutamin	Biologische Industrien	01-100-1A

Zell-