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>1. Herstellung von humanen embryonalen Stammzellen (hESC)-qualifizierten Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten
- Tauen Sie die hESC-qualifizierte Basalmembran-Matrix-Lösung (siehe Materialtabelle) bei 4 °C für mindestens 2–3 h oder über Nacht langsam auf, um die Bildung eines Gels zu vermeiden.
- Zur Herstellung von Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten verdünnen Sie die Matrix in kaltem Dulbecco's Modified Eagle Medium mit F12 (DMEM+F12) auf eine Endkonzentration von 2 %. Gut mischen und jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1 ml der verdünnten Matrixlösung bestreichen.
- Die mit Basalmembranmatrix beschichteten Platten werden mindestens 3 h bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht bei 4 °C inkubiert.
Anmerkung: Platten mit Basalmembranmatrix können 1 Woche lang bei 4 °C gelagert werden, bevor die Matrizenlösung entfernt und die Platten verwendet werden.
>2. Anpassung von hES-Zellen vom Kolonietyp an einzellige hES-Kulturen
- Um die feederfreien Kulturen von hES-Zellen vom Typ H9 (WA09), die auf der Basalmembranmatrix gezüchtet wurden, zu passieren, aspirieren Sie das Medium aus den Vertiefungen (Abbildung 1A).
- 1x mit 1 mL DPBS waschen. 1 ml Dispaselösung (1 U/ml) pro Vertiefung zugeben und 20 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
- Entfernen Sie die Trennung, waschen Sie die Zellen 1x vorsichtig mit 2 mL DMEM/F12, entfernen Sie das Medium und geben Sie 2 mL DMEM/F12 auf jede Platte.
- Lösen Sie die Kolonien vorsichtig ab, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren und in ein 15-ml-Röhrchen umfüllen.
- Zentrifugieren Sie die Pellets für 2 min bei 370 x g und saugen Sie das Medium an.
- Um die Zellpellets in einzelne Zellen zu dissoziieren, fügen Sie 2 mL Zellablösungslösung (1x Konzentration, siehe Materialtabelle) hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 10 min.
- Die Zellen 2 min lang bei 370 x g zentrifugieren und die Ablöselösung entfernen.
- Geben Sie frisches humanes mTeSR1-Esc-Medium hinzu und dissoziieren Sie die Zellen durch sanftes Auf- und Abpipettieren in einzelne Zellen.
- Um hES-Zellen vom Kolonietyp an eine Einzelzellkultur anzupassen, werden ca. 1,5–2,0 x 106 hES-Zellen in jede Vertiefung der Basalmembran-Matrix-beschichteten 6-Well-Platte in 2 ml mTeSR1 mit 10 μM ROCK-Inhibitor für 24 Stunden plattiert (Abbildung 1A).
- Nach 24 h wird das hES-Medium durch frisches mTeSR1 ohne ROCK-Inhibitor ersetzt und die hES-Zellen 3 Tage lang als Einzelzelltyp wachsen gelassen. Wechseln Sie das Medium täglich.
- Am Tag 4, wenn die Kulturen eine Konfluenz von nahezu 100 % erreichen, dissoziieren die Zellen in Ablösung, dann replizieren Sie sie wie in Schritt 2.6.
beschrieben
Anmerkung: Der ROCK-Inhibitor verbessert das Überleben der Zellen während der ersten 24 Stunden der Einzelzell-Typ-hES-Kultur.
>3. Unterscheidung von einzelligen hESCs in NPCs (Abbildung 2)
- Um die NPC-Differenzierung zu induzieren, dissoziieren einzellige hES-Zellen mit 1 mL Ablöselösung (1x) und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 37 °C.
- Die Zellen werden 2 Minuten lang bei 370 x g zentrifugiert und der Überstand der Ablöselösung entfernt. Fügen Sie 1 ml DMEM/F12 hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren.
- Plattenzellen auf einer Basalmembranmatrix-beschichteten 6-Well-Platte mit einer Dichte von 2 x 105 Zellen/Well in 2 mL mTeSR1 mit 10 μM ROCK-Inhibitor.
- Nach 24 h wird das Kulturmedium durch ein neuronales Induktionsmedium (DMEM mit 1 % B27 minus Vitamin A) ersetzt, das mit 1 μM Dorsomorphin und 5 μM SB431542 ergänzt wird.
- Wechseln Sie das Medium während der ersten 4 Tage der neuronalen Induktion jeden zweiten Tag, dann jeden Tag bis zum Erreichen der Konfluenz an Tag 7 (Abbildung 2B).
HINWEIS: (1) Dorsomorphin hemmt den BMP-Signalweg, indem es auf ALK2,3,6-Rezeptoren abzielt und auch AMPK hemmt; SB431542 ist ein Inhibitor des TGFβ/Activin-Signalwegs, indem es auf ALK5,7 abzielt. (2) Das gleiche Protokoll wurde mit einer anderen ESC-Linie (WA01) getestet, die ähnliche Ergebnisse wie WA09 lieferte. (3) Wir haben im Allgemeinen Matrigel für die Basalmembranmatrix verwendet; Zellen können jedoch auf Geltrex kultiviert und dann in NPCs differenziert werden, mit sehr ähnlichen Ergebnissen, wie die Expression mehrerer NPC-Marker zeigt (Abbildung 3D, E). Behandeln Sie Geltrex auf die gleiche Weise wie Matrigel (siehe Abschnitt 1).
