Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Sterilisation von Materialien
HINWEIS: Alle Materialien und Lösungen müssen vor der Verwendung sterilisiert werden.
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und das Vibrationsschneidmaterial (Messerhalter, Probenscheibe, Pufferschale) in einem trockenen Sterilisationsofen für 4 h bei 180 °C.
- Sterilisieren Sie temperaturempfindliche Materialien oder Geräte durch UV- oder Gammabestrahlung.
- Sterilisieren Sie Medien und Lösungen durch Autoklavieren oder Filtration durch 0,22 μm Porenmembranen.
>2. Vorbereitung von Lösungen
- Bereiten Sie 15-20 ml Transportlösung vor: 50 % v/v Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS) pH 7,4, 50 % v/v Basalmedium zur Erhaltung von postnatalen und adulten Gehirnneuronen (Materialtabelle), ergänzt mit 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure (HEPES), 3 mg/ml Glukose und 33 μg/ml Gentamicin.
Anmerkung: Die Transportlösung muss vor der Probenentnahme mindestens 20 Minuten lang gekühlt und mit Sauerstoff angereichert werden (Blasenbildung mit Carbogengas).
- Bereiten Sie 300 mL Schnittlösung vor (HBSS ergänzt mit 10 mM HEPES und 3 mg/mL Glukose) und kühlen Sie sie in einem Gefrierschrank bis zur anfänglichen Kristallbildung ab.
- Bereiten Sie 20 ml Nährmedium vor: Basalmedium für die Erhaltung von postnatalen und adulten Gehirnneuronen (Materialtabelle), ergänzt mit 1 % L-Glutaminderivat (Materialtabelle), 2 % Zusatz für die neuronale Kultur (Materialtabelle), 1 % Penicillin/Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B.
>3. Einrichten des Schneidegeräts
HINWEIS: Dieses Protokoll wird aufgrund der Logistik der Probenentnahme im Operationssaal idealerweise mit Hilfe eines Kollegen durchgeführt.
- Lassen Sie die Schneidelösung in einem Eimer mit Salzeis mindestens 20 Minuten vor der Verwendung unter der sprudelnden Carbogen-Mischung (95 % O2, 5 % CO2) ruhen.
- Bereiten Sie einen Block aus 3 % Agarose (ca. 2 cm x 2 cm x 2 cm) vor und kleben Sie ihn mit Sekundenkleber auf die Vibratom-Probenscheibe, um der Gewebeprobe während des Schneidens zusätzlichen mechanischen Halt zu geben (Abbildung 1E).
- Stellen Sie das Vibratom für das Schneiden ein: Schnittdicke von 200 μm, Vibrationsfrequenz von 100 Hz und Schnittgeschwindigkeit zwischen 0,5 und 1,0 mm/s.
- Verriegeln Sie die Vibratom-Pufferschale mit der Vibratom-Basis und fügen Sie Eis hinzu, um sie vor der Aufnahme der Schneidlösung und der Probe sowie während des gesamten Schneidevorgangs gekühlt zu halten.
>4. Probenentnahme
HINWEIS: In diesem Protokoll wurde menschliches neokortikales Gewebe im Operationssaal gesammelt und zum Labor transportiert.
VORSICHT: Befolgen Sie beim Umgang mit menschlichen Proben die entsprechenden Sicherheitsprotokolle, die von der Institution festgelegt wurden.
- Richten Sie die Transportvorrichtung (Abbildung 1C) ein, die besteht aus: einer tragbaren Gasflasche mit Carbogen-Gemisch, die mit einem Druck-/Flussventil verbunden ist, das den Gasausgang steuert, verbunden mit einem Silikonschlauch, der den Gasausgang mit dem Transportbehälter verbindet; einem Transportgefäß, normalerweise einem konischen 50-ml-Zentrifugenrohr mit perforiertem Deckel für den Gaszulauf, die Transportlösung enthalten; und Eis zur Probenkühlung während des Transports.
- Sammeln Sie die Probe (Abbildung 1B) und transportieren Sie sie sofort ins Labor. Tauchen Sie die Probe in kalte Transportlösung (ständig mit Carbogenmischung beblasen).
>5. Schneiden
- Übertragen Sie die Probe in eine Petrischale (100 mm x 20 mm) mit Schnittlösung und entfernen Sie mit feinen chirurgischen Instrumenten vorsichtig so viel wie möglich von den verbleibenden Hirnhäuten in der Probe (Abbildung 1D).
- Wählen Sie die beste Probenausrichtung für die Herstellung von Scheiben mit den besonderen Eigenschaften des Versuchsdesigns und schneiden Sie mit einer Skalpellklinge Nr. 24 eine ebene Oberfläche ab, die als Basis auf die Probenscheibe geklebt wird.
- Sammeln Sie mit einem Einweg-Plastiklöffel und feinen Pinseln das Fragment aus der Petrischale und trocknen Sie die überschüssige Lösung mit Filterpapier (trocken durch Kapillarität und vermeiden Sie es, das Gewebefragment mit Papier zu berühren).
- Befestigen Sie das Gewebe mit Sekundenkleber an der Vibratom-Probenscheibe, bis es fest mit der Scheibe verbunden ist und mit dem Agaroseblock in Kontakt kommt (Abbildung 1E).
- Legen Sie die Vibratom-Probenscheibe (mit ordnungsgemäß befestigtem Gewebe) in die Vibratom-Pufferschale, die mit Schnittlösung gefüllt ist, die während des gesamten Prozesses Blasen bilden muss.
- Verriegeln Sie den Messerhalter mit fester Rasierklinge.
- Die Schneidlösung muss sowohl die Probe als auch die Klinge bedecken, erst dann beginnt man mit dem Schneiden (Abbildung 1F).
- Schneiden Sie die Probe in 200 μm große Scheiben.
Anmerkung: Obwohl einige Vibratome die Proben automatisch schneiden, können die genaue Beobachtung und geringfügige Anpassungen der Schnittgeschwindigkeit während des Prozesses dazu beitragen, bessere Schnitte zu erzeugen. Verwerfen Sie anfängliche unregelmäßige Scheiben.
- Übertragen Sie die Scheiben aus der Pufferschale in eine Petrischale mit Schnittlösung und schneiden Sie lose Ränder und überschüssige weiße Materie auf einen Anteil von etwa 70 % Cortex/30 % weißer Substanz ab.
>6. Kultur
HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in einem Laminar-Flow-Schrank in steriler Umgebung durch.
- Geben Sie 600 μl Nährmedium pro Vertiefung (in einer 24-Well-Platte) hinzu und inkubieren Sie mindestens 20 Minuten bei 36 °C und 5 % CO2, bevor Sie die Scheiben plattieren.
- Plattieren Sie eine Scheibe pro Vertiefung mit einem Pinsel (Abbildung 1G).
- Wenn sich unbenutzte Vertiefungen in der Platte befinden, füllen Sie diese mit 400 μl sterilem Wasser.
- Inkubieren Sie die Platte bei 36 °C, 5 % CO2,
Anmerkung: Der erste Mediumwechsel muss je nach Größe der Scheibe zwischen 8 und 16 Stunden nach dem Plattieren erfolgen.
- Ergänzen Sie 10 ml des zuvor vorbereiteten Kulturmediums mit 50 ng/ml brainderived neurotrophic factor (BDNF).
Anmerkung: Während der ersten 8-16 Stunden werden die Scheiben in 600 μl Medium inkubiert, um Nährstoffmangel und Übersäuerung zu vermeiden, da der Verbrauch des Mediums in dieser Phase beschleunigt wird. Im nächsten Schritt wird das Volumen des Mediums pro Vertiefung auf 400 μl eingestellt.
- Entnehmen Sie 333 μl des konditionierten Mediums aus jeder Vertiefung und fügen Sie 133 μl frisches, mit BDNF ergänztes Medium hinzu.
- Wiederholen Sie den Vorgang des Mediumwechsels alle 24 Stunden, indem Sie ein Drittel des konditionierten Mediums durch frisches, mit BDNF ergänztes Medium ersetzen.
