Isolierung und Kultivierung von Mikroglia aus Rattengehirnen mit serumfreien Medien

Zusammenfassung

Quelle: Collins, H. Y., et al., Isolierung und Kultur von Nagetier-Mikroglia zur Förderung einer dynamisch verzweigten Morphologie in serumfreiem Medium. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Mikroglia aus Rattengehirnen. Dabei werden Mikroglia von anderen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen mit Hilfe von Platten getrennt, die mit einem monoklonalen Antikörper beschichtet sind, der spezifisch für Mikroglia ist.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Bereiten Sie eine Petrischale für die CD11b-Immunpanning vor (Tag 0)

HINWEIS: Bereiten Sie 1 Immunpanning-Schale für jeweils 1 - 2 juvenile Rattengehirne zu.

1. Geben Sie 25 ml 50 mM Tris pH 9,5 Lösung in eine 15 cm große Petrischale.
2. Geben Sie Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L-Ketten) in die Schale, um eine Endkonzentration von 6 μg/ml zu erreichen. Schwenken Sie die Platte, um sie gleichmäßig zu verteilen.
3. Das Gericht 1 - 3 h bei 37 °C inkubieren.
4. Spülen Sie das Geschirr dreimal mit DPBS++ (phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Ca²⁺ und Mg²⁺) und ersetzen Sie es dann durch eine Lösung aus Panning-Puffer, die 1 μg/ml OX42-Antikörper enthält. Lassen Sie das Geschirr über Nacht bei Raumtemperatur auf einer ebenen Fläche stehen.

>2. Gewebeentnahme (Tag 1)

HINWEIS: Dieses Protokoll sollte ~3 - 4 Stunden dauern.

1. Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass alle Lösungen steril und auf Eis gekühlt sind. Kühlen Sie alle Instrumente auf Eis und sterilisieren Sie sie vor der Verwendung mit Ethanol
.
2. Nach entsprechenden behördlichen Verfahren tötet man eine juvenile Laborratte durch Kohlendioxid-Erstickung.
   Anmerkung: Alternativ können jüngere Tiere mit einer tödlichen Dosis Ketamin/Xylazin (100 - 200 μl 24 mg/ml Ketamin, 2,4 mg/ml Xylazin) getötet werden. Ketamin/Xylazin muss verwendet werden, wenn die Tiere jünger als 14 Tage sind. Wenn Sie mehrere Tiere verwenden, extrahieren Sie das Gewebe von einem Tier und legen Sie es in vorgekühltes ^DPBS++ auf Eis, bevor Sie es an die nachfolgenden Tiere weitergeben.
3. Kneifen Sie eine Hinterpfote und stellen Sie sicher, dass das Tier völlig unempfänglich ist, bevor Sie fortfahren.
Das
4. Tier wird transkardial mit 10 - 30 ml eiskaltem Perfusionspuffer mit einer 271/2-G-Nadel perfundiert, bis der Puffer klar ist.
   Anmerkung: Das Volumen des Perfusionspuffers variiert je nach Größe/Alter des Tieres.
5. Entfernen Sie sofort nach der Perfusion den Kopf des Tieres. Aus dem Rückenmark kommend, schneiden Sie den Hinterhauptkondylus auf jeder Seite mit einer Präparierschere durch, achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu beschädigen. Nachdem Sie jede Seite vorsichtig geschnitten haben, schneiden Sie eine Seite entlang des Scheitel- und Stirnbeins in Richtung Nasenbein auf. Ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Oberseite des Schädels zurück, entfernen Sie schnell das Gehirn (oder die ZNS-Strukturen) und legen Sie es in vorgekühltes ^DPBS++ auf Eis.
6. Wiederholen Sie den Vorgang für alle übrigen Tiere.
   Anmerkung: Alle weiteren Schritte sollten in einer Laminar-Flow-Haube unter geeigneten sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

>3. Mechanische Dissoziation (Tag 1)

1. Nachdem alle Gehirne gesammelt wurden, hacken Sie ein Gehirn in einer Petrischale auf Eis mit einer kalten Skalpellklinge in 1 mm³ Stücke und geben Sie es in einen eiskalten Homogenisator mit 5 - 7 mL eiskaltem Teigpuffer. Dissoziieren Sie ein Gehirn nach dem anderen.
2. Dissoziieren Sie das Gewebe mit 10 - 20 sanften und unvollständigen Hüben mit einem locker sitzenden Dounce-Homogenisator. Achten Sie darauf, das Gewebe nicht direkt am Boden des Homogenisators zu zerquetschen, sondern das Gewebe durch den Raum zwischen den Seiten des Kolbens und des Homogenisators zu treiben.
3. Entfernen Sie vorsichtig den Kolben, um das Eindringen von Luftblasen zu verhindern. Lassen Sie schlecht dissoziierte Gewebestücke am Boden des Homogenisators absetzen und überführen Sie den Überstand in ein neues gekühltes konisches 50-ml-Röhrchen.
4. Ersetzen Sie das entfernte Volumen durch frischen Brausepuffer und wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.3 für insgesamt 3 - 4 Runden oder bis das gesamte Gewebe dissoziiert ist. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Gehirn.

>4. Myelinentfernung (Tag 1)

HINWEIS: Die Myelinentfernung wird zur Isolierung von Mikroglia von Tieren verwendet, die älter als P12 sind.

1. Messen Sie das Volumen der Zellsuspension im konischen 50-ml-Röhrchen mit einer 25-ml-Pipette und fügen Sie dann eiskalten Douzierungspuffer hinzu, um das Gesamtvolumen auf 33,5 mL einzustellen.
2. Geben Sie 10 ml Myelin-Separationspuffer (MSB) in die Zellsuspension und mischen Sie gründlich, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Dies führt zu einer Endkonzentration von 23 % MSB in einem Volumen von 43,5 ml.
3. Zellen 15 min bei 500 x g bei 4 °C mit langsamem Bremsen zentrifugieren.
   Anmerkung: Das Abbremsen der Zentrifuge sollte ca. 1,5 - 2 Minuten dauern. Dadurch entsteht eine obere Schicht aus Myelin und abgestorbenen Zelltrümmern, ein etwas trüber Überstand und ein kleineres Pellet, das für lebende Zellen angereichert ist.
4. Entfernen Sie die oberste Schicht aus Myelin/Schmutz und den Überstand mit einer Pipette. Achten Sie beim Entfernen der obersten Schicht darauf, dass so viel wie möglich davon entfernt wird.
5. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 12 mL Panning-Puffer. Zerreiben Sie die Zellsuspension vorsichtig, um eventuell verbleibende Zellklumpen aufzubrechen.

>5. Immunpanning (Tag 1)

1. Führen Sie die Zellsuspension durch ein 70-μm-Zellsieb, um große Ablagerungen oder Zellklumpen zu entfernen.
2. Spülen Sie die OX42-beschichtete Pannenschale dreimal mit DPBS++ aus. Lassen Sie die Platte zwischen den Wäschen nicht vollständig trocknen.
3. Gießen Sie die letzte DPBS++-Wäsche ab und tragen Sie die gefilterte Zellsuspension auf die Panning Dish auf. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen zu verteilen, und inkubieren Sie die Platte dann 20 Minuten lang auf einer ebenen Fläche bei Raumtemperatur, damit die Zellen haften können. Inkubieren Sie nicht länger als 20 Minuten, da es sonst sehr schwierig wird, sich von den Zellen aus der Schale zu erholen.
4. Spülen Sie die Panning Dish 10 Mal mit DPBS++ aus, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Mikroglia werden fest mit der Platte verbunden, also schwenken Sie die Platte bei jedem Spülgang, um sicherzustellen, dass andere nicht haftende Zellen entfernt werden.
5. Gießen Sie die letzte ^DPBS++-Wäsche ab und ersetzen Sie sie durch 15 ml DPBS++ und 200 μl Trypsin (1,25%ige Stammlösung).
6. Das Gericht ≤10 min bei 37 °C mit 10 % CO₂ inkubieren, um es zu trypsinisieren.
   Anmerkung: Fahren Sie nicht länger als 10 Minuten fort, da sonst die Mikroglia schwer zu entfernen sind.
7. Nach 10 Minuten Trypsinisierung kleben die Mikroglia immer noch an der Platte. Gießen Sie Trypsin/^DPBS++ ab und waschen Sie es vorsichtig 2x mit ^DPBS++, um Trypsin zu entfernen, ersetzen Sie es durch 12 mL eiskaltes Mikroglia-Wachstumsmedium (MGM).
8. Stellen Sie die Panning Dish für 2 Minuten auf Eis, um die Interaktion zwischen Zellen und Substrat zu schwächen, und stellen Sie sicher, dass die Schale flach ist, um zu verhindern, dass Bereiche der Panning Dish austrocknen.
9. Pipettieren Sie kräftig mit einer 10-ml-Pipette und einer Pipettiersteuerung bei hoher Geschwindigkeit, um Zellen aus der Schwenkschale zu gewinnen. Zeichnen Sie ein 16 x 16 Gitter mit dem Flüssigkeitsstrahl aus der Pipette, um zu versuchen, alle Zellen zu entfernen.
10. Überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass sich die Zellen von der Platte gelöst haben. Markieren Sie Stellen auf der Oberseite der Schale, an denen noch Zellen festsitzen, und wiederholen Sie das Pipettieren in diesen Bereichen.
11. Sammeln Sie die Zellsuspension und aliquotieren Sie 3 - 4 ml Überstand pro konischem 15-ml-Röhrchen. 15 min bei 500 x g bei 4 °C langsam bremsen.
    Anmerkung: Das Spinnen von Mikroglia durch ein kleines Volumen ermöglicht eine maximale Rückgewinnung der Zellen.
12. Aspirieren Sie den Überstand, wobei 0,5 ml MGM mit dem Zellpellet verbleiben.
13. Suspendieren Sie jedes Pellet im restlichen MGM und poolen Sie die Zellen aus allen Röhrchen.
14. Zählen Sie die Zellen mit dem Hämozytometer.
15. Plattenzellen wie in den Schritten 6 - 7 beschrieben, je nach Anwendung.
16. Kultivierung von Zellen bei 37 °C mit 10 % CO₂,
    Anmerkung: Die Zellen können bis zu 3 - 4 Wochen lang mit regelmäßigem Medienwechsel oder eine Woche ohne Medienwechsel kultiviert werden.

>6. Spotbeschichtung von Gewebekulturplatten/Deckgläsern (Tag 1)

1. 15 μl Kollagen-IV-Beschichtung direkt in der Mitte einer 24-Well-Gewebekulturplatte mit anionisch/kationisch beschichteter Gewebekultur auffüllen (siehe Materialtabelle für Details) und 15 min bei 37 °C mit 10 % CO₂ inkubieren.
2. Nach der Zählung der Zellen mit dem Hämozytometer verdünnen Sie die Zellen auf 2,3 x 10⁵/ml in MGM. Aspirieren Sie den Kollagen-IV-Punkt und plattieren Sie sofort 15 μl Zellsuspension an diese Stelle; Dies ergibt 3,5 x 10³ Zellen/Spot. 5 - 10 min bei 37 °C mit 10 % CO₂ inkubieren, damit die Zellen haften können, und 500 μl CO 2-äquilibriertes TGF-β2/IL-34/cholesterinhaltiges Wachstumsmedium (TIC) vorsichtig in die Vertiefung geben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Douncing-Puffer			Rezept: 200 μl 0,4 % DNaseI in 50 mL DPBS++ Bemerkungen: Im eiskalten Zustand verwenden
Panning-Puffer			Rezept: 2 mg/ml Pepton aus Milchfeststoffen in DPBS++
Mikroglia-Wachstumsmedium (MGM)			Rezept: DMEM/F12 enthält 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2 mM Glutamin, 5 μg/ml N-Acetylcystein, 5 μg/ml Insulin, 100 μg/ml Apo-Transferrin und 100 ng/ml Natriumselenit Kommentare: Verwenden Sie eiskaltes MGM, um Mikroglia von der Immnopanning-Schale zu schwenken.
Kollagen IV Beschichtung			Rezeptur: MGM mit 2 μg/ml Kollagen IV
Myelin-Trennungs-Puffer			Rezept: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS ohne Ca++ und Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Bemerkungen: Nach der Zugabe von CaCl2 und MgCl2 gut mischen
Trypsin	Sigma	Nr. T9935
DMEM/F12	Gibco	Artikel-Nr.: 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Nr. 15140-122
DMEM (hoher Glukosespiegel)	Gibco	Tel.: 11960-044
Kollagen IV			Rekonstitution: 200 μg/mL in PBS Verwendete Konzentration: 1:100 Lagerung: -80°C
Anti-Ratten-CD11b für Maus monoklonal (Klon OX42)	Bio-Rad	MCA275R	Schwenken: 1:1.000; Abfärben: 1:500
TGF-b2/IL-34/Cholesterinhaltige Wachstumsmedien (TIC)			Rezept: MGM enthält humanes 2 ng/ml TGF-b2, 100 ng/ml murines IL-34, 1,5 μg/ml Schafwolle-Cholesterin, 10 μg/ml Heparansulfat, 0,1 μg/ml Ölsäure und 0,001 μg/ml Gondosäure Anmerkungen: Achten Sie darauf, Cholesterin in Medien zu geben, die auf 37 °C erwärmt sind, und fügen Sie nicht mehr als 1,5 μg/ml hinzu, da es sonst ausfällt. Filtern Sie keine cholesterinhaltigen Medien. Äquilibrieren Sie TIC-Medien 30 Minuten bis 1 Stunde lang mit 10 % CO2, bevor Sie sie den Zellen hinzufügen, um einen optimalen pH-Wert zu gewährleisten.
Percoll PLUS	GE Gesundheitswesen	Kategorie# 17-5445-02
Primaria Platten	VWR	Kat# 62406-456
DNaseI	Worthington	Kat# DPRFS