Präparation von Hirnschnitten mit einer NMDG-basierten protektiven Wiederherstellungsmethode

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Ting, J. T. et al. Vorbereitung von akuten Hirnschnitten unter Verwendung einer optimierten N-Methyl-D-Glucamin-Protective Recovery Method. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Gewinnung von Hirnschnitten mit einer auf N-Methyl-D-Glucamin (NMDG) basierenden protektiven Rückgewinnungsmethode. Ein präpariertes Gehirn wird in einem aCSF mit NMDG und HEPES inkubiert, um den neuronalen Zelltod und die Schädigung während der Schnittung zu minimieren. Der Schnitt darf sich im Liquor erholen, um die zellulären Aktivitäten wiederherzustellen

Protokoll

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>1. Dissektion und Schneiden des Gehirns

Enthaupte das Tier. Öffne mit einem Skalpell die Haut am Kopf und lege die Schädelkappe frei.
Schneiden Sie mit einer feinen Super-Cut-Schere die Haut über der Schädelkappe ab und machen Sie seitlich auf beiden Seiten kleine Schnitte an der kaudalen/ventralen Schädelbasis. Machen Sie weitere flache Schnitte, beginnend an der kaudalen/dorsalen Seite des Schädels, und bewegen Sie sich in rostraler Richtung entlang der dorsalen Mittellinie, wobei Sie darauf achten, das darunter liegende Gehirn nicht zu beschädigen. Machen Sie einen abschließenden T-Schnitt senkrecht zur Mittellinie auf Höhe der Riechkolben.
Anmerkung: Es muss darauf geachtet werden, dass die interessierende(n) Gehirnregion(en) nicht geschädigt werden. Insbesondere sollte zu keinem Zeitpunkt eine Druckkraft auf das Gehirn selbst ausgeübt werden.
Fassen Sie den Schädel mit der Rundzange mit der runden Spitze, beginnend bei der rostral-medialen Seite und ziehen Sie ihn in kaudal-lateraler Richtung zurück. Wiederholen Sie dies für beide Seiten, um aufzubrechen und die hinteren Hälften der Schädelkappe zu entfernen, um das Gehirn freizulegen. Schöpfen Sie das intakte Gehirn vorsichtig in das Becherglas mit vorgekühltem NMDG-HEPES aCSF. Lassen Sie das Gehirn ~1 Minute lang gleichmäßig abkühlen.
Heben Sie das Gehirn mit dem großen Spatel aus dem Becherglas auf die mit Filterpapier bedeckte Petrischale. Trimmen und blockieren Sie das Gehirn entsprechend dem bevorzugten Schnittwinkel und der gewünschten Gehirnregion. Arbeiten Sie schnell, um einen längeren Sauerstoffmangel während der Handhabung zu vermeiden.
Anmerkung: Viele Schnittwinkel sind möglich. Die genaue Blockierungsmethode und der Schnittwinkel hängen von der genauen Gehirnregion, dem Zelltyp und dem zu untersuchenden Schaltkreis ab.
Befestigen Sie den Hirnblock mit Klebekleber auf dem Probenhalter. Ziehen Sie das innere Stück des Probenhalters so weit zurück, dass die Hirnblockade vollständig nach innen gezogen wird. Gießen Sie die geschmolzene Agarose direkt in den Halter, bis der Gehirnblock vollständig mit Agarose bedeckt ist. Klemmen Sie den vorgekühlten Zubehörkühlblock ~10 s lang um den Probenhalter, bis die Agarose erstarrt ist.
Setzen Sie den Probenhalter in die Aufnahme an der Schneidemaschine ein und überprüfen Sie die korrekte Ausrichtung. Füllen Sie das Reservoir mit dem restlichen vorgekühlten, sauerstoffhaltigen NMDG-HEPES aCSF aus dem 250-ml-Becherglas und schieben Sie einen Blasenstein für die Dauer des Schneidens in das Reservoir, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten.
Stellen Sie das Mikrometer so ein, dass die in Agarose eingebettete Gehirnprobe vorgeschoben wird. Starten Sie den Slicer und stellen Sie die Vorschubgeschwindigkeit und die Schwingungsfrequenz empirisch auf den gewünschten Pegel ein.
Anmerkung: Beide Einstellungen sollten im niedrigen Bereich liegen. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollte ein einziger Durchgang des Klingenarms etwa 20 s dauern und die Oszillation sollte ein sehr gleichmäßiges und sanftes Brummen ohne offensichtliches Brummen erzeugen.
Fahren Sie mit dem Vorschieben und Schneiden des Gewebes in Schritten von 300 μm (oder einer anderen bevorzugten Dicke) fort, bis die interessierende Gehirnregion vollständig geschnitten ist; die Gesamtzeit für den Schneidevorgang sollte weniger als 15 Minuten betragen.

>2. Optimiertes NMDG-Schutzwiederherstellungsverfahren

Erster NMDG-Rückgewinnungsschritt (kritischer Schritt): Nach Abschluss des Schnittvorgangs werden alle Scheiben mit einer abgeschnittenen Pasteurpipette aus Kunststoff entnommen und in eine vorgewärmte (34 °C) Erstauffangkammer gegeben, die mit 150 mL NMDG-HEPES aCSF gefüllt ist. Übertragen Sie alle Scheiben in kurzer Folge und starten Sie einen Timer, sobald alle Scheiben in die Auffangkammer verschoben wurden.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name

Unternehmen

Katalognummer

Kommentare

Kompresstom VF-200

Präzisionsinstrumente

VF-200

Vibrierender Gewebeschneider (empfohlen)

N-Methyl-D-glukamin

Sigma Aldrich

Nr. M2004

aGFK-Bestandteil

Natriumchlorid

Sigma Aldrich

Nr. S3014

aGFK-Bestandteil

Kaliumchlorid

Sigma Aldrich

Nr. P5405

aGFK-Bestandteil

Monobasisches Natriumphosphat-Dihydrat

Sigma Aldrich

Artikel-Nr.: 71505

aGFK-Bestandteil

Natriumbicarbonat

Sigma Aldrich

Nr. S5761

aGFK-Bestandteil

HEPES

Sigma Aldrich

Nr. H4034

aGFK-Bestandteil

Traubenzucker

Sigma Aldrich

Nr. G7021

aGFK-Bestandteil

Natriumascorbat

Sigma Aldrich

Nr. A4034

aGFK-Bestandteil

Thioharnstoff

Sigma Aldrich

Nr. T8656

aGFK-Bestandteil

Natriumpyruvat

Sigma Aldrich

Nr. P5280

aGFK-Bestandteil

Calciumchlorid-Dihydrat

Sigma Aldrich

Nr. C7902

aGFK-Bestandteil

Magnesiumsulfat-Heptahydrat

Sigma Aldrich

M1880

aGFK-Bestandteil

Gebogene stumpfe Pinzette

Werkzeuge für die Feinwissenschaft

Artikel-Nr.: 11065-07