Eine Technik zur verlängerten Inkubation von neuronalem Gewebe der Netzhaut

Zusammenfassung

Quelle: Cameron, M. A., et al. Verlängerte Inkubation von akutem neuronalem Gewebe für Elektrophysiologie und Kalzium-Bildgebung. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video zeigt eine Methode zur verlängerten Inkubation von neuronalem Gewebe der Netzhaut. Augenmuscheln, die Netzhaut enthalten, werden aus einem Mausauge gewonnen; Die innere Grenzmembran (ILM) wird enzymatisch verdaut, um die neuronalen Zellen der Netzhaut freizulegen, und entweder die behandelte Augenmuschel oder die isolierte Netzhaut wird für eine längere Inkubation bei niedriger Temperatur in einen speziellen Inkubator überführt.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Retinale Wholemount-Präparation und Entfernung der inneren Grenzmembran

1. Bereiten Sie retinale Wholemounts entweder unter normalen Laborlichtbedingungen oder unter gedämpftem Rot-/Infrarotlicht vor.
2. Euthanasieren Sie das Tier durch Gebärmutterhalsluxation und enukleieren Sie sofort die Augen. Machen Sie einen kleinen Schnitt entlang der Ora serrata und geben Sie es entweder in Ames media oder in künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF), die (mM) enthält: 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 3 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 Glukose, 0,5 L-Glutamin und sättigen Sie es mit Carbogen (95% O₂/5% CO₂ -Gemisch; ~300 mOsm; pH 7,4) bei Raumtemperatur (RT).
3. Entfernen Sie sofort die Hornhaut, die Linse und den Glaskörper, indem Sie mit einer kleinen Schere entlang der Ora serrata schneiden und die Linse und den Glaskörper mit einer Pinzette entfernen. Legen Sie das Gewebe in das Inkubationssystem bei RT.
   Anmerkung: Das Netzhautgewebe kann nach langsamer Temperaturabsenkung auf 15 - 16 °C für >24 h im Inkubationssystem bis zur Verwendung in der Augenmuschel gehalten werden.
4. Um die ILM zu entfernen, übertragen Sie die Augenmuschel mit der Netzhaut in ein kleines Glas mit 30 U/ml Papain, 1 mM L-Cystin, 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,005 % Desoxyribonuklease (DNase) in Earl's Balanced Salt Solution (BSS) bei 37 °C für 20 Minuten. Tragen Sie 95 % O₂/5 % CO₂ durch den Deckel auf die Lösung auf, aber sprudeln Sie nicht. Wenn Sie Gewebe von Jungtieren (<6 Wochen) verwenden, verdünnen Sie die Lösung auf die halbe Stärke.
   1. Stoppen Sie die enzymatische Verdauung, indem Sie das Gewebe 10 Minuten lang in eine Lösung mit Ovomucoid (10 mg/ml) und Rinderserumalbumin (BSA, 10 mg/ml) in Earl's BSS legen. Waschen Sie das Gewebe gründlich mit aCSF, bevor Sie es in das Inkubationssystem überführen, und reduzieren Sie die Temperatur auf 15 - 16 °C.
5. Halten Sie das Netzhautgewebe bis zur Verwendung in der Augenmuschel. Für die Übertragung auf das Mikroskop isolieren Sie die Netzhaut von der Augenmuschel und schneiden sie mit einer Rasierklinge in 4 Stücke. Wenn die gesamte Netzhaut benötigt wird, machen Sie vier kleine Schnitte in die Peripherie der Netzhaut, damit sie flach liegen kann.
   Anmerkung: Für bildgebende Experimente vor dem Transfer in das Inkubationssystem mit Calciumfarbstoffen beladen, siehe unten.

>2. Gewebe im Inkubator halten

1. Legen Sie das Gewebe in die Hauptkammer mit Sonden für pH- und Temperaturmessungen (Abbildung 1A, B).
2. ACSF wird durch eine zweite Kammer (UVC-Kammer, die wie zuvor beschrieben aufgebaut ist) zirkuliert, die von der Hauptkammer isoliert ist und 1,1 W ultraviolettem C (UVC)-Licht (254 nm, 5W/2P Sterilisator-UV-Lampe) ausgesetzt ist, um in der Lösung schwimmende Bakterien zu beseitigen (Abbildung 1A). Steuern Sie das Timing des UVC-Lichts über einen programmierbaren Timer mit einer Zufallsfunktion, die sich alle 15 bis 30 Minuten zu Zeiten zwischen 15 und 26 Minuten einschaltet, um eine übermäßige Erwärmung des aCSF zu vermeiden.
3. Stellen Sie die Durchflussrate in der UVC-Kammer wie zuvor berichtet auf 12 ml/min ein. Decken Sie die UVC-Kammer mit Aluminiumfolie ab, um eine UVC-Beleuchtung außerhalb der Kammer zu verhindern, die das neuronale Gewebe schädigen kann.
   Anmerkung: Bei dunkeladaptiertem Netzhautgewebe tragen Sie eine maßgeschneiderte Abdeckung auf die Hauptkammer auf, um Licht auszuschließen.
4. Verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um die Lösung (aCSF) durch die beiden Kammern zu zirkulieren, und einen thermoelektrischen Peltier-Kühler, um die Hauptkammer entweder zu kühlen oder auf die gewünschten Temperaturen im Bereich von 0 - 50 °C zu erwärmen. Für eine optimale Gewebeinkubation verwenden Sie 15 - 16 °C für eine langfristige Lebensfähigkeit.

Ergebnisse

Abbildung 1. Ein Inkubationssystem, das eine strenge Regulierung der Gewebeumgebung ermöglicht. A, Schematische Darstellung des Inkubationssystems, bestehend aus einer kühlenden Peltierplatte, einer Hauptkammer, einer Peristaltikpumpe und einer UVC-Kammer. B, Seitenansicht der Hauptkammer mit den Ein- und Austrittspunkten des aCSF sowie dem Carbogen-Einlass, der Temperatur- und pH...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Natriumchlorid	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Kaliumchlorid	Sigma Aldrich	Nr. 9333
N-Methyl-D-glukamin	Sigma Aldrich	Nr. M2004
D-Glukose	Sigma Aldrich	Nr. G5767
Natriumbicarbonat	Sigma Aldrich	Nr. S6014
Magnesiumchlorid	Sigma Aldrich	M9272
Calciumchlorid	Sigma Aldrich	223506
Papain-Dissoziationssystem	Worthington	LK003150
Aufrechtes Mikroskop mit festem Tisch	Olymp	BX51WI
Mikroskop-Objektiv	Olymp	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20-mal
Mikroskop-Objektiv	Olymp	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60-mal
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelektrischer Kühler	TE-Technologie	CP-121
Temperaturregler	TE-Technologie	TC-36-25 RS232