1. Vorbereitung von Materialien und Nährmedium
- Für die Dissektion und Dissoziation der SCZ (subkallosale Zone) wickeln Sie die Hirnmatrix, die zweischneidige Rasierklinge und die Pinzette mit Alufolie ein und sterilisieren Sie sie anschließend durch Autoklavieren.
- Bereiten Sie 50 ml kalten PBS-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) vor, um das gesamte Gehirn der Maus zu waschen.
- Stellen Sie ein Dissektionsmikroskop auf und bereiten Sie die chirurgischen Instrumente vor, die für die Dissektion des Gehirns (autoklavierte Schere und Pinzette) und die Isolierung der SCZ (1 ml Spritze, 30 G Nadel, Hirnmatrix und feine Pinzette) erforderlich sind.
- Zubereitung von N2 Medium:
- Bereiten Sie F-12/DMEM (+L-Glutamin, +Natriumbicarbonat) Medium mit 2 % B27, 1 % N2-Ergänzungen und 1 % Penicillin-Streptomycin vor.
Hinweis: Das Wachstumsmedium besteht aus N2-Medium und Wachstumsfaktoren (20 ng/ml gereinigter epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und 20 ng/ml basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF2)).
- Bereiten Sie einen Verdauungspuffer (40 Einheiten/ml Papain, 2,4 Einheiten/ml Dispase II und 2 % Penicillin-Streptomycin in PBS) für die Gewebeverdauung vor.
- Vorbereitung der Beschichtungsplatte und des Deckglases:
- Bereiten Sie Poly-L-Ornithin (PLO; 0,01%) und Laminin (10 μg/ml gelöst inDH2O) vor. Um 6-Well-Platten für die Konservierung von SCZ-aNSCs (Adulte neurale Stammzellen) als Monoschicht oder 18-mm-Deckgläser für die Immunfärbung zu beschichten, inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C mit PLO. Anschließend 3 Mal mit DH2O waschen. Lassen Sie die Teller und Deckgläser nach dem letzten Waschen trocknen.
- Anschließend werden die Platten über Nacht bei 4 °C mit Laminin inkubiert. Dann 3 Mal mit DH2O.
Achtung: Trocknen Sie das Laminin nicht, da dies die Zelladhäsion beeinträchtigt.
Hinweis: Die Beschichtungslösungen können 3 Mal wiederverwendet werden.
2. Isolation und Dissoziation der erwachsenen SCZ
- Legen Sie vor der Kulturvorbereitung die Gehirnmatrix und den zweischneidigen Rasierer auf Eis.
Hinweis: Frieren Sie die Gehirnmatrix nicht ein, da sich das Gehirn daran anheften könnte.
- Opfern Sie eine Maus (8 Wochen alt) durch CO2 -Erstickung oder Gebärmutterhalsluxation.
- Schneiden Sie den Kopf mit einer scharfen Schere ab, nachdem Sie 70%iges Ethanol versprüht haben. Um den Kopf ruhig zu stellen, halten Sie beide Seiten des Kopfes fest. Schneiden Sie die Haut mit einer Schere an der Mittellinie in kaudal-rostraler Richtung ein. Dies fördert die vollständige Entfernung der Haut vom Schädel.
- Entfernen Sie zuerst den kaudalen Teil des Schädels (hinter dem Lambda) und führen Sie dann die Pinzette zwischen Schädel und Gehirn in der dorsalen Mittellinienposition ein. Greifen Sie nach dem linken (oder rechten) Scheitelknochen und schälen Sie ihn vorsichtig ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Entfernung des anderen Scheitelknochens.
Hinweis: Die Trennung des Sehnervs und die Entfernung der Hirnhäute aus dem Gehirn erleichtern die Trennung des Gehirns vom Schädel.
- Übertragen Sie das Gehirn in kalten PBS-Puffer (25 ml) und spülen Sie ihn zweimal aus, um überschüssiges Blut zu entfernen.
- Legen Sie das Gehirn auf Eis in die Gehirnmatrix und machen Sie koronale Schnitte, um 1 mm dicke Scheiben zu erhalten. Die Hirnschnitte (1 mm) mit den SCZ-Regionen, die sich im hinteren Teil des Gehirns befinden, werden in eine kalte PBS in einer 35 mm Petrischale aus Kunststoff übertragen.
Vorsicht: Um eine parallele Ebene der koronalen Schnitte zu erhalten, stellen Sie sicher, dass die Hirnspalte in der Mittellinie der Hirnmatrix platziert wird. Es ist wichtig, unnötige Variationen in den Abschnitten zu vermeiden.
Anmerkung: Entnehmen Sie Hirnschnitte 2-3 mm hinter dem Bregma; Dies ermöglicht die Trennung der SCZ von der SVZ (subventrikuläre Zone).
- Unter dem Präpariermikroskop mit geringer Vergrößerung wird das SCZ mit einer gebogenen 30G-Nadel aus dem Bereich der weißen Substanz des Kortex und des Hippocampus mikropräpariert6,9. Entfernen Sie dann die Kortexregionen oberhalb der SCZ. Legen Sie die präparierte SCZ-Region aus den Scheiben ohne Kälte in eine 35 mm große Petrischale aus Kunststoff auf Eis.
Anmerkung: Die Kontamination zusätzlicher Regionen, die reife Neuronen enthalten, könnte die Lebensfähigkeit von aNSCs und die Bildung von Neurosphären beeinträchtigen, da sie unter aNSC-Kulturbedingungen dem Zelltod unterliegen.
Mit - einer gebogenen 30-G-Nadel das präparierte Gewebe sofort in kleine Stücke schneiden.
Anmerkung: Wenn für das Präparieren des SCZ-Gewebes eine längere Zeit benötigt wird, tauchen Sie das präparierte Gewebe vor dem Zerkleinern in kaltes PBS.
- Das gehackte Gewebe wird erneut mit 1 ml Verdauungspuffer suspendiert, das Gewebe in ein 15-ml-Röhrchen mit 2 ml Verdauungspuffer überführt und 30 Minuten lang in einem 37°C warmen Wasserbad inkubiert.
Anmerkung: Schütteln Sie die Tube alle 10 Minuten, um sie gut zu vermischen.
3. Aus der subkallosalen Zone abgeleitete adulte neuronale Stammzellkultur
- Klopfen Sie leicht auf das Röhrchen, um das verdaute Gewebe zu dissoziieren, und zentrifugieren Sie das Röhrchen dann 5 Minuten lang bei 145 x g. Entsorgen Sie den Überstand, suspendieren Sie das verdaute Gewebe erneut mit 1 ml vorgewärmtem N2-Medium, um den Aufschlusspuffer auszuwaschen, und pipetieren Sie die Probenlösung vorsichtig maximal 5 Mal mit einer P1000-Pipette.
Anmerkung: Übermäßiges Verreiben mit einer schmalen Pipettenspitze kann die Lebensfähigkeit der Zellen und das anschließende Wachstum verringern.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 145 x g für 5 min. Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Zellpellet in 1 ml N2-Medium wieder suspendiert.
- Bereiten Sie 1 ml N2-Medium in einer unbeschichteten 6-Well-Platte vor und fügen Sie 1 ml der suspendierten Zellen hinzu, um ein Endvolumen von 2 ml zu erhalten.
- EGF (20 ng/ml) und bFGF (20 ng/ml) in jede Vertiefung geben. Schütteln Sie die 6-Well-Kulturschale vorsichtig von Hand, um die zugesetzten Wachstumsfaktoren mit den plattierten Zellen zu vermischen. Bewahren Sie die 6-Well-Platte in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 auf.
- EGF (20 ng/ml) und bFGF (20 ng/ml) 8 Tage lang täglich in jede Vertiefung geben. Fügen Sie jeden dritten Tag 200 μl N2-Medium hinzu, um das Volumen des Mediums von ca. 2 ml zu erhalten.
4. Passage von NSCs als Neurosphären und in Monolayer-Kulturen
- Sammeln Sie die Neurosphären und übertragen Sie sie in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen.
Hinweis: Die Anzahl der Neurosphären (>50 μm Durchmesser) pro Vertiefung aus der SCZ eines einzelnen Mausgehirns betrug 64,3 ± 7,31 und war damit geringer als die der SVZ (190,5 ± 6,33).
- Inkubieren Sie die Neurosphären mit 0,5 ml Dissoziationspuffer für 5 min in einem 37°C Wasserbad, um die Neurosphären in einzelne Zellen zu dissoziieren. Primäre Neurosphären können in einzelne Zellen dissoziiert und über mehrere Passagen als Neurosphären oder Monolayer-Kulturen aufrechterhalten werden.
Anmerkung: Die Expansion von SCZ-aNSCs als Monoschicht ist Neurosphären überlegen, da SCZ-aNSCs in einem Monolayer-Kulturformat >10 Mal, in einem Neurosphären-Kulturformat jedoch <5 Mal durchgelassen werden können.
Vorsicht: SCZ-aNSCs weisen eine starke Aggregation auf, und es ist schwierig, sie in einzelne Zellen zu zerlegen. Daher wird das Neurosphärenkulturformat nicht für die routinemäßige Zellexpansion empfohlen.
- Pipettieren Sie die Probenlösung weniger als 5 Mal vorsichtig mit einer P1000-Pipette auf und ab und zentrifugieren Sie das Röhrchen 5 Minuten lang bei 145 x g. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Neurosphären erneut mit 1 ml N2-Medium.
Anmerkung: Eine Übertituierung mit einer schmalen Pipettenspitze kann die Lebensfähigkeit der Zellen und das anschließende Wachstum verringern.
- Um die Zellen zu zählen, stellen Sie eine 1:1-Mischung aus der Zellsuspension (10 μl) und der 0,4%igen Trypanblau-Lösung her und zählen Sie dann die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämatozytometer. Nachdem Sie eine 6-Well-Platte mit PLO/Laminin beschichtet haben, plattieren Sie die Zellen mit 2,5 x 105 Zellen/ml mit 2 ml N2-Medium für jede Vertiefung.
Anmerkung: Veränderungen der Zelldichte können sich auf ihren Zustand und ihr Differenzierungspotenzial auswirken.
- Halten Sie die SCZ-aNSCs mit einer täglichen Behandlung mit Wachstumsfaktoren (2 ml, 20 ng/ml) für 5 Tage aufrecht und lassen Sie sie dann passieren.
5. Differenzierung von adulten neuralen Stammzellen aus der subkallosalen Zone
- Platte aNSCs auf ein PLO/Laminin-beschichtetes 18 mm Deckglas mit 1 x 105 Zellen/ml in 1 ml N2 mit Wachstumsfaktoren (20 ng/ml) zur Differenzierung der SCZ-aNSCs.
- Am nächsten Tag, wenn die Zellen fest mit dem Deckglas verbunden sind, tauschen Sie das Wachstumsmedium gegen N2 aus, um die Wachstumsfaktoren zu entfernen.
- Waschen Sie die differenzierten Zellen nach 6 Tagen mit 1 ml PBS, um Zelltrümmer zu entfernen und sie für die Immunfärbung zu fixieren.
Hinweis: BrdU kann in die neu synthetisierte DNA proliferierender Zellen eingebaut werden. Daher kann auf Wunsch BrdU (10 μg/ml) vor der Fixierung der Zellen zu lebenden Zellen zugesetzt werden.
