$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Vorbereitung von MEAs
Hinweis: MEAs bestehen aus einem Glassubstrat, mikrofabrizierten Metallelektroden und einer SU-8-Polymer-Isolationsschicht. Für die Zwecke dieser Studie wurden kommerziell erhältliche MEAs mit einem kundenspezifischen Elektrodenarray-Layout bestellt (Abbildung 1 A&B). Die 68 Elektroden sind in einem rechteckigen Raster angeordnet, das durch eine 300 μm breite Nut frei von Elektroden, elektrischen Leitungen und Isolierung in zwei Zonen geteilt ist. Jede Elektrode ist 40 x 40 μm groß und hat einen Abstand von 200 μm von Zentrum zu Zentrum. Vier große Masseelektroden sind um die Aufnahmestelle herum positioniert. Sie unterscheiden sich von anderen handelsüblichen Standard-MEAs durch ihre Größe (21 mm x 21 mm) und haben keine feste Aufnahmekammer.
- Zur Desinfektion MEAs in 100% Ethanol (2x), 70% Ethanol (1x) und destilliertem Wasser (2x) jeweils mindestens 30 Sekunden spülen. Trocknen lassen. 10 - 12 MEAs in eine saubere Petrischale aus Glas (150 mm x 25 mm) geben und den Deckel schließen.
- MEAs 20 min bei 120 °C autoklavieren. Bei RT lagern.
- Bereiten Sie die Beschichtungslösung (siehe Materialliste) für die MEAs vor und lagern Sie die Aliquote bei -20 °C.
- Legen Sie jedes MEA in eine einzelne sterile Petrischale (35 mm x 10 mm).
- Mit einer gekühlten Pipette 150 μl gekühlte Beschichtungslösung auf die Elektroden geben und den Deckel der Petrischale schließen. Prüfen Sie nach ca. 10 min die Elektroden auf Luftblasen und entfernen Sie diese bei Bedarf vorsichtig mit einem mit Gummi überzogenen Spatel. 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) ruhen lassen.
- Rückstände der Beschichtungslösung aspirieren, 1x mit Medium waschen, das für pränatale und embryonale Neuronen optimiert ist, und 2x mit destilliertem, sterilem Wasser. Wenn MEAs erst am nächsten Tag verwendet werden, bewahren Sie sie über Nacht in destilliertem, sterilem Wasser bei 37 °C im Inkubator auf (O/N). Ansonsten direkt bei RT trocknen lassen.
>2. Erforderliche Zutaten für die Vorbereitung und das Wachstum organotypischer Kulturen
- Bereiten Sie eine kalziumfreie Waschlösung vor (siehe Materialliste).
- Hühnerplasma in Waschlösung rekonstituieren (1:1, leicht schütteln, Blasenbildung vermeiden), bei 3.000 x g ca. 20 min zentrifugieren und den klaren Inhalt in ein steriles Röhrchen umfüllen. 200 μl in Kryoröhrchen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- Thrombin aus Rinderplasma entsprechend rekonstituieren (200 U/ml) und Sterilfilter (0,2 μm Porenfilter). 200 μl in Krytoröhrchen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- Für 30 Kulturen 100 ml Nährmedium vorbereiten (siehe Materialliste).
>3. Dissektion von Rückenmarksgewebe
Hinweis: Das Verfahren liefert, abhängig von der Anzahl der Embryonen, Rückenmarksschnitte für etwa 25 - 35 Co-Kulturen und wird in einer Laminar-Flow-Haube unter sterilen Bedingungen vorbereitet.
- Wenden Sie eine tödliche Dosis Pentobarbital (0,4 ml) durch intramuskuläre Injektion auf das Muttertier an. Bestätigen Sie die Tiefenanästhesie, indem Sie den Pedalrückzugsreflex überprüfen. Entbindung von embryonalen Rattenembryonen am Tag 14 (E14) per Kaiserschnitt und Tötung durch Enthauptung.
- Übertragen Sie die Körper der Embryonen in eine Petrischale, die mit steriler, gekühlter Waschlösung gefüllt ist.
- Führen Sie einen vollständigen Querschnitt mit einem Skalpell über den Hintergliedmaßen und einen weiteren über den Vordergliedmaßen durch und entfernen Sie die Gliedmaßen vom Körper. Machen Sie als Nächstes einen Schnitt in der Frontebene, um die Eingeweide vom Rückenteil zu trennen, das das Rückenmark enthält.
- Zum Schneiden werden die Rückenstücke, die das Rückenmark enthalten, nacheinander auf eine Montagescheibe übertragen und mit einem Gewebehäcksler in einer Dicke von 225 - 250 μm geschnitten. Geben Sie einen Tropfen Waschlösung auf das gehackte Tuch und geben Sie die Scheiben mit einem Spatel in 35 mm x 10 mm große Petrischale, die mit steriler, gekühlter Waschlösung gefüllt sind.
- Präparieren Sie für jeden Schnitt separat das Rückenmark vom restlichen Gewebe weg. Lassen Sie die Spinalganglien befestigt.
- Die Scheiben 1 Std. bei 4 °C ruhen lassen.
>4. Montieren von Rückenmarksgewebeschnitten auf MEAs
- Steriles Nährmedium im Inkubator erwärmen (37 °C, Deckel für Sauerstoffzufuhr leicht abgeschraubt).
- Positionieren Sie MEA mit einer sterilen Pinzette mit gummiüberzogenen Spitzen bei RT in der Petrischale unter einem Stereomikroskop mit dem Elektrodenarray im Fokus. Zentrieren Sie ein 6-μl-Tröpfchen Hühnerplasma auf dem sauberen, staubfreien und sterilen Elektrodenarray. Schieben Sie mit einem kleinen Spatel vorsichtig zwei Rückenmarksabschnitte mit den Bauchseiten zueinander in das Plasmatröpfchen. Berühren Sie die Elektroden nicht mit dem Spatel.
- Geben Sie 8 μl Thrombin um das Hühnerplasma-Tröpfchen. Mit der Thrombin-Pipettenspitze die Mischung aus Hühnerplasma und Thrombin vorsichtig mischen und auf den beiden Scheiben verteilen. Auch hier gilt: Berühren Sie das spröde Elektrodenarray nicht direkt. Kurz vor der Gerinnung überschüssiges Hühnerplasma/Thrombin aspirieren.
- Verschließen Sie die Petrischale, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu erhalten, während die MEA/Kulturbaugruppe etwa 1 Stunde lang in einer befeuchteten Kammer im Inkubator bei 37 °C verbleibt.
- Vorsichtig 10 μl Nährmedium in die Kulturkammer geben, die Petrischale verschließen und für ca. 30 min wieder in den Inkubator stellen.
- Legen Sie jede MEA-/Kultureinheit mit sterilen, gummiummantelten Spitzen in ein Rollröhrchen, fügen Sie 3 ml Nährmedium hinzu und schließen Sie den Deckel fest. Legen Sie das Rollenrohr in die mit 1 - 2 U/min rotierende Walzentrommel im Inkubator in einer 5% CO2 -haltigen Atmosphäre bei 37 °C.
- Wechseln Sie die Hälfte des Nährmediums nach 7 Tagen in vitro (DIV) und danach 1 - 2 Mal pro Woche.
>5. Mechanische Läsionen
- Nehmen Sie die MEA/Kultur-Baugruppe mit sterilen, gummiummantelten Spitzen aus dem Rollröhrchen und legen Sie sie in eine Petrischale ohne Nährmedium unter ein Stereomikroskop mit dem Gewebe im Fokus. Überprüfen Sie visuell, ob die beiden Slices verschmolzen sind.
- Halten Sie die MEA/Kultur-Baugruppe ruhig, indem Sie eine Pinzette mit gummiüberzogenen Spitzen auf den MEA legen.
- Platzieren Sie eine Skalpellklinge in der Rille des MEA in der Nähe der Gewebeschnitte. Halten Sie das Skalpell eher waagerecht.
- Heben Sie den Skalpellgriff an, lassen Sie die Skalpellklinge aber so in der Rille des MEA bleiben, dass die Klinge von der Basis bis zur Spitze "rollt" und dadurch das Gewebe durchtrennt, das die Rille bedeckt.
- Eventuelle Gewebeverbindungen mit einer 25 G Nadelspitze verschließen, falls erforderlich. Arbeiten Sie nur im Bereich innerhalb der Rille und berühren Sie nicht die zarten Kanten.
- Setzen Sie die MEA/Kulturbaugruppe wieder in das Rollenrohr ein. Geben Sie den Kulturen 3 ml frisches Nährmedium und geben Sie sie zurück in die Rolltrommel im Inkubator.
>6. Elektrophysiologische Aufzeichnungen spontaner Aktivität
- Um die funktionelle Regeneration zwischen den beiden Rückenmarksschnitten nach der gewählten Anzahl von DIV zu untersuchen, montieren Sie die MEA/Kultur-Einheit in einer Aufnahmekammer an einem Mikroskop und tragen Sie etwa 500 μl extrazelluläre Lösung auf (siehe Materialliste).
- Warten Sie 10 Minuten vor der ersten Aufnahme, damit sich das System stabilisieren kann.
- Zeichnen Sie die grundlegende spontane Aktivität 2x für ca. 10 Minuten von jeder aktivitätsdetektiven Elektrode des MEA bei RT auf.
- Um stabile extrazelluläre Bedingungen zu gewährleisten, tauschen Sie die extrazelluläre Lösung nach jeder Aufnahmesitzung aus.
