>1. Aussaat von humanen iPSCs im Bioreaktor
- Inkubieren Sie iPSCs, die als Monolayer in mTeSR1 gezüchtet wurden, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632 (ROCKi). Geben Sie 1 ml supplementiertes Medium aus einer 6-Well-Gewebekulturplatte in jede Vertiefung und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2,
Anmerkung: ROCKi wird verwendet, um dissoziierte iPSCs vor Apoptose zu schützen.
- Nach 1 Stunde Inkubation das verbrauchte Medium aus jeder Vertiefung aspirieren und 1x mit 1 ml 1× PBS pro Vertiefung waschen.
- Geben Sie 1 ml des Zellablösemediums (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte und inkubieren Sie 7 Minuten lang bei 37 °C, bis sich die Zellen durch leichtes Schütteln aus den Vertiefungen lösen.
- Pipettieren Sie das Zellablösungsmedium mit einer P1000-Mikropipette auf und ab, bis sich die Zellen ablösen und in einzelne Zellen dissoziieren. Geben Sie 2 ml vollständiges Zellkulturmedium in jede Vertiefung, um den enzymatischen Verdau zu inaktivieren, und pipettieren Sie die Zellen vorsichtig in ein steriles konisches Röhrchen.
- Bei 210 × g 3 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in Kulturmedium (d. h. mTeSR1 ergänzt mit 10 μM ROCKi) und zählen Sie die iPSCs mit einem Hämozytometer unter Verwendung von Trypanblau-Farbstoff
.
- 15 × 10 6 Einzelzellen im Bioreaktor (maximales Volumen von 100 mL) mit 60 mL mTeSR1, ergänzt mit 10 μM ROCKi, bei einer endgültigen Zelldichte von 250.000 Zellen/mL aussäen.
- Setzen Sie das Gefäß mit den iPS-Zellen in die Universal-Basiseinheit ein, die bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2,
in den Inkubator gestellt wird.
Anmerkung: Das Rühren des Bioreaktors wird 24 Stunden lang aufrechterhalten, indem die universelle Steuerung des Basisgeräts auf 27 U/min eingestellt wird, um die iPSC-Aggregation zu fördern.
>2. Differenzierung und Reifung von humanen iPSC-abgeleiteten Aggregaten in Kleinhirnorganoiden
- Definieren Sie den Tag des Einzelzell-Seedings als Tag 0.
- Entnehmen Sie an Tag 1 1 ml der Probe der iPS-Aggregate mit einer serologischen Pipette. Halten Sie den Bioreaktor wie bisher unter Rühren, indem Sie die Universal-Basiseinheit mit dem Bioreaktor mit den Aggregaten in einen sterilen Fluss bringen, bevor Sie die Probe entnehmen. Plattieren Sie die Zellsuspension in einer 24-Well-Platte mit extrem geringer Befestigung. Überprüfen Sie, ob iPSC-abgeleitete Aggregate gebildet werden.
- Erfassen Sie Bilder mit einem optischen Mikroskop mit einer Gesamtvergrößerung von 40x oder 100x, um den Gesamtdurchmesser zu messen.
- Messen Sie die Fläche der Aggregate in jedem Bild mit der FIJI-Software.
- Wählen Sie "Analysieren | Messungen einstellen" aus der Menüleiste und klicken Sie auf "Bereich" und "OK".
- Wählen Sie "Datei | Öffnen" in der Menüleiste, um eine gespeicherte Bilddatei zu öffnen. Wählen Sie das Linienauswahlwerkzeug in der Symbolleiste aus und erstellen Sie eine gerade Linie über der im Bild dargestellten Maßstabsleiste. Wählen Sie "Analysieren | Maßstab einstellen" aus der Menüleiste.
- Fügen Sie unter "Bekannte Entfernung" die Ausdehnung des Maßstabsbalkens des Bildes in μm hinzu. Definieren Sie die "Längeneinheit" als μm. Klicken Sie auf "Global", um die Einstellungen beizubehalten, und auf "OK". Wählen Sie in der Symbolleiste die Option "Ovale Auswahl" aus.
- Markieren Sie für jedes Aggregat die Fläche mit dem ovalen Werkzeug. Wählen Sie "Analysieren | Messen". Berechnen Sie ihren Durchmesser basierend auf der gemessenen Fläche, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Aggregate annähernd kugelförmig sind
mit A als Fläche des Aggregats.
- Wenn der durchschnittliche Durchmesser der Zuschlagstoffe 100 μm beträgt, werden 80 % des verbrauchten Mediums durch frisches mTeSR1 ohne ROCKi ersetzt. Wenn die Aggregate einen Durchmesser von 200 bis 250 μm erreichen, ersetzen Sie das gesamte verbrauchte Medium durch gfCDM (Tabelle 1), sodass sich die Organoide am Boden des Bioreaktors absetzen können.
Anmerkung: Wenn der durchschnittliche Aggregatdurchmesser 350 μm überschreitet, starten Sie das Differenzierungsprotokoll nicht. Wiederholen Sie das Seeding einzelner Zellen. In der Regel dauert es etwa 1 Tag, bis das Aggregat einen durchschnittlichen Durchmesser von 100 μm erreicht.
- Setzen Sie den Bioreaktor mit den Zuschlagstoffen in die universelle Basiseinheit ein, die bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 in den Inkubator gestellt wird.
- Verringern Sie die Bewegung des Bioreaktors auf 25 U/min.
- Wiederholen Sie an Tag 2 die Schritte 2.2, 2.3 und 2.4, um den Aggregatdurchmesser zu bewerten. 30 μl FGF2 (Endkonzentration, 50 ng/ml) und 60 μl SB431542 (Endkonzentration, 10 μM) zu 60 mL gfCDM-Differenzierungsmedium geben (Tabelle 1). Ersetzen Sie das gesamte verbrauchte Medium aus dem Bioreaktor durch das ergänzte gfCDM. Wiederholen Sie Schritt 2.6.
HINWEIS: SB431542 ist entscheidend, um die mesendodermale Differenzierung zu hemmen und die neuronale Differenzierung zu induzieren. FGF2 wird verwendet, um die Kaudalisierung des neuroepithelialen Gewebes zu fördern.
- Wiederholen Sie an Tag 5 die Schritte 2.2, 2.3, 2.4 und 2.8.
Anmerkung: Die Aggregatgröße sollte während des Differenzierungsprotokolls zunehmen. Der Durchmesser ist jedoch erst zu Beginn der Differenzierung kritisch, da dieser Parameter die Wirksamkeit der Differenzierung beeinflussen könnte.
- Wiederholen Sie an Tag 7 die Schritte 2.2, 2.3 und 2.4. FGF2 und SB431542 auf 2/3 verdünnen: 20 μl FGF2 und 40 μl SB431542 bis 60 ml gfCDM-Differenzierungsmedium zugeben. Ersetzen Sie das gesamte verbrauchte Medium aus dem Bioreaktor durch ergänztes gfCDM. Schritt 2.6 wiederholen und die Rührung des Bioreaktors auf 30 U/min erhöhen.
- Wiederholen Sie an Tag 14 die Schritte 2.2, 2.3 und 2.4. 60 μl FGF19 (Endkonzentration, 100 ng/ml) zu 60 mL gfCDM-Differenzierungsmedium hinzufügen. Ersetzen Sie das gesamte verbrauchte Medium aus dem Bioreaktor durch gfCDM, das mit FGF19 ergänzt wird. Wiederholen Sie Schritt 2.6.
Anmerkung: FGF19 wird verwendet, um die Polarisation der Strukturen des mittleren Hinterhirns zu fördern.
- Wiederholen Sie an Tag 18 die Schritte 2.2, 2.3, 2.4 und 2.11.
- Wiederholen Sie an Tag 21 die Schritte 2.2, 2.3 und 2.4. Ersetzen Sie das gesamte verbrauchte Medium aus dem Bioreaktor durch vollständiges neurobasales Medium (Tabelle 1). Wiederholen Sie Schritt 2.6.
Anmerkung: Neurobasales Medium ist ein basales Medium, das verwendet wird, um die neuronale Zellpopulation innerhalb des Organoids aufrechtzuerhalten.
- Wiederholen Sie an Tag 28 die Schritte 2.2, 2.3 und 2.4. Fügen Sie 180 μl SDF1 (Endkonzentration, 300 ng/ml) zu 60 ml vollständigem neurobasalem Medium hinzu. Ersetzen Sie das gesamte verbrauchte Medium aus dem Bioreaktor durch vollständiges neurobasales Medium, das mit SDF1 ergänzt wird. Wiederholen Sie Schritt 2.6.
Anmerkung: SDF1 wird verwendet, um die Organisation verschiedener Zellschichten zu erleichtern.
- Wiederholen Sie an Tag 35 die Schritte 2.2, 2.3 und 2.4. Ersetzen Sie das gesamte verbrauchte Medium aus dem Bioreaktor durch vollständiges BrainPhys-Medium (Tabelle 1). Wiederholen Sie Schritt 2.6.
Anmerkung: BrainPhys ist ein neuronales Medium, das synaptisch aktive Neuronen unterstützt.
- Ersetzen Sie alle 3 Tage 1/3 des Gesamtvolumens durch vollständiges BrainPhys Medium bis zum 90. Tag der Differenzierung.
Tabelle 1: Stammlösungen und Medienvorbereitung. Aufgelistet sind alle Komponenten und Volumina, die zur Vorbereitung von Medien für das iPS-Protokoll zur Aufrechterhaltung und Differenzierung verwendet werden, sowie Stammlösungen von Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen. Bei Stammlösungen sind alle Stammkonzentrationen und Protokolle für die Rekonstitution aufgeführt.
| Vorbereitung der Medien | mTeSR1
Endvolumen: 500 mL | 1. mTeSR1 5× über Nacht bei Raumtemperatur (RT) oder 4 °C auftauen und mit dem Basalmedium
2. Lagern Sie das gesamte mTeSR1-Medium bis zu 2 Wochen lang bei 4 °C oder bereiten Sie 40 mL Aliquots vor und lagern Sie es bei -20 °C
3. Vollständiges mTeSR1 vor der Verwendung bei RT vorwärmen |
gfCDM (Wachstumsfaktor-freies chemisch definiertes Medium)
Endvolumen: 60 mL | 30 mL Ham's F12 30 mL IMDM 600 μl chemisch definiertes Lipidkonzentrat (1 % v/v) 2,4 μl Monothioglycerin (450 μM) 30 μl Apo-Transferrin (Stammlösung zu 30 mg/mL in Wasser, Endkonzentration: 15 μg/ml) 300 mg kristallisationsgereinigtes BSA (5 mg/ml) 42 μl Insulin (Stammkonzentration bei 10 mg/ml, Endkonzentration: 7 μg/ml) 300 μL P/S (0,5 % v/v, 50 U/ml Penicillin/50 μg/ml Streptomycin) |
Neurobasal
Endvolumen: 60 mL | 60 mL Neurobasalmedium, 600 μl N2-Supplement, 600 μl Glutamax I, 300 μL P/S (0,5 % v/v). |
Komplettes BrainPhys
Endvolumen: 60 mL | 60 ml BrainPhys 1,2 mL NeuroCult SM1 Neuronales Supplement 600 μl N2 Supplement 12 μl BDNF (Endkonzentration: 20 ng/mL) 12 μl GDNF (Endkonzentration: 20 ng/mL) 300 μl Dibutyryl-cAMP (Stammkonzentration: 100 mg/mL in Wasser, Endkonzentration: 1 mM) 42 μl Ascorbinsäure (Stammkonzentration: 50 μg/mL in Wasser, Endkonzentration: 200 nM) |
| Stammlösungen von Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen | Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF/FGF2)
Stammkonzentration: 100 μg/mL | 1. Rekonstitution in 5 mM Tris, pH 7,6, in einer Konzentration von 10 mg/ml
2. Mit 0,1 % BSA in PBS (v/v) auf eine Endbestandskonzentration von 100 μg/ml verdünnen |
Stromazell-abgeleiteter Faktor 1 (SDF1)
Stammkonzentration: 100 μg/mL | 1. Rekonstitution in Wasser in einer Konzentration von 10 mg/ml
2. Mit 0,1 % BSA (v/v) in PBS auf eine Endbestandskonzentration von 100 μg/ml verdünnen. |
Vom Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor (BDNF)
Stammkonzentration: 100 μg/ml< |
Gliazell-abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF)
Stammkonzentration: 100 μg/mL |
Fibroblasten-Wachstumsfaktor 19 (FGF19)
Stammkonzentration: 100 μg/mL | 1. Rekonstitution in 5 mM Natriumphosphat, pH 7,4, in einer Konzentration von 10 mg/ml
2. Mit 0,1 % BSA in PBS (v/v) auf eine Endbestandskonzentration von 100 μg/ml verdünnen |
| ROCK-Inhibitor Y-27632<br />
Bestandskonzentration: 10 mM | Rekonstituiert in DMSO bei einer Konzentration von 10 mM. |
SB431542
Bestandskonzentration: 10 mM |
Insulin
Stammkonzentration: 10 mg/mL | 1. Rekonstituieren Sie 10 mg Insulin in 300 μl 10 mM NaOH
2. Vorsichtig 1 M NaOH zugeben, bis die Lösung klar-transparent wird
3. Füllen Sie bis zu 1 mL mit sterilem Wasser |
Tabelle 2: Lösungen zur Herstellung von Organoiden für die Kryosektion und Immunfärbung. Aufgelistet sind alle Komponenten und Volumina, die zur Herstellung der Lösungen verwendet werden, die bei der Herstellung von Organoiden für die Kryosektion und Immunfärbung verwendet werden.
Gelatine/Saccharose
Endkonzentration: 7,5 %/15 Gew.-% | 1. 15 g Saccharose und 7,5 g Gelatine in einer sterilen Schott Glasflasche abwiegen und gut vermischen
2. PBS 1× auf 65 °C vorwärmen
3. Vorgewärmtes PBS 1× auf ein Endgewicht von 100 g geben und gut verrühren
4. Stellen Sie die Schott Glasflasche in eine Heizplatte bei 65 °C und schütteln Sie, bis die Gelatine schmilzt
5. Bei 37 °C inkubieren, bis sich die Lösung stabilisiert hat |
