Isolierung tumorinfiltrierender Immunzellen aus einem Gehirn von Mäusen

Zusammenfassung

Quelle: Baker, G. J., et al., Lowenstein, P. R. Isolierung und durchflusszytometrische Analyse von Gliom-infiltrierenden mononukleären Zellen des peripheren Blutes. J. Vis. (2015)

Das Video zeigt die Isolierung von tumorinfiltrierenden mononukleären Zellen des peripheren Blutes aus einem Mäusegehirn durch mechanische Dissoziation und enzymatische Verdauung. Daran schließt sich eine Dichtegradientenzentrifugation an, um die Immunzellen für die weitere Analyse zu sammeln.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

Bereiten Sie eine Dichte-Zentrifugationsmedien-Mischlösung vor, indem Sie 90 ml 10x PBS in 264 ml ultrareines deionisiertes Wasser (3,93x) in einen sterilen Kunststoffbehälter geben. Titrieren Sie mit HCl auf pH 7,0-7,2 und sterilisieren Sie den Filter durch einen 0,22 μm-Filter. Bei 4 °C lagern.

Bereiten Sie Zentrifugationsmedien mit 70% Dichte vor, indem Sie 18 ml Dichtezentrifugationsmedien-Mischlösung mit 30 ml Dichtezentrifugationsmedium (siehe Materialliste für Details) in einem 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen kombinieren. Bei 4 °C lagern, aber vor Gebrauch auf RT stellen.

Bereiten Sie Zentrifugationsmedien mit 37 % Dichte vor, indem Sie 9,6 ml DPBS mit 10,4 ml Zentrifugationsmedien mit 70 % Dichte in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen kombinieren. Bei 4 °C lagern, aber vor Gebrauch auf RT stellen.

>1. Isolierung von Gliom-infiltrierenden PBMCs

1. Isolieren Sie mit einer sauberen, einschneidigen Rasierklinge den Bereich des Gehirns, in dem sich der Tumor befindet, indem Sie einen sagittalen Schnitt in der Mitte des Gehirns machen, um die beiden Hemisphären zu halbieren. Drehen Sie die ipsilaterale Hemisphäre mit der medialen Seite nach unten und machen Sie zwei koronale Schnitte auf Höhe des Kleinhirns und des Riechkolbens, um das Zielgewebe zu isolieren, das das Tumorimplantat enthält (Abbildung 1A). Ein gleichwertiger Teil der kontralateralen Hemisphäre kann auch isoliert und als Negativkontrolle verwendet werden.
2. Legen Sie das Zielgewebe in den entsprechend beschrifteten Dounce Gewebeschleifer mit 1 ml DPBS, drücken Sie den Kolben ganz nach unten und drehen Sie ihn 7 Mal, um das Gewebe zunächst zu stören. Heben Sie den Kolben an, damit sich die Flüssigkeit wieder auf dem Boden des Tissue-Grinders absetzen kann. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal; Drehen Sie den Kolben jedoch nur 4 Mal während der nächsten zwei Wiederholungen und 3 Mal während der letzten Wiederholung, um eine Überreibung des Gewebes zu vermeiden.
3. Tragen Sie mit einer P-1000-Mikropipette nacheinander drei 1-ml-Volumina eiskaltes DPBS an den Seiten des Kolbens auf, um es in den Tissue-Grinder zu spülen.
4. Resuspendieren Sie die verreibte Gehirnsubstanz, indem Sie auf und ab pipettieren und in ein beschriftetes 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis legen. Spülen Sie die Seiten des Dounce Tissue-Grinders mit 1 zusätzlichen ml eiskaltem DPBS ab und geben Sie es in dasselbe 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Bewahren Sie alle Röhrchen mit verreibter Hirnsubstanz auf Eis auf, bis alle Proben verarbeitet wurden.
5. Sobald alle Proben verarbeitet sind, wird die verreibte Hirnsubstanz in den 15-ml-Zentrifugenröhrchen bei 740 x g (max. RCF) für 20 Minuten bei 4 °C heruntergeschleudert.
6. Entfernen Sie den Überstand mit einer serologischen 10-ml-Pipette und einer Pipettenpistole und resuspendieren Sie die pelletierte Hirnsubstanz in 1 ml der zuvor hergestellten Kollagenase/DNase-I-Verdauungsenzyme mit einem P-1000. Legen Sie die 15 ml Zentrifugenröhrchen in ein Reagenzglasgestell und stellen Sie sie für 15 min in ein 37 °C warmes Wasserbad.
7. Rühren Sie die Proben während der Inkubationszeit zweimal vorsichtig um, indem Sie die Röhrchen schnippen, um die Gewebedisaggregation zu erleichtern.
8. Geben Sie 6 ml eiskaltes DPBS mit einer 10 ml serologischen Pipette in jedes Röhrchen, um die Verdauungsenzyme zu verdünnen. Pipettieren Sie zum Resuspendieren auf und ab und filtrieren Sie das Gesamtvolumen durch sterile 70-μm-Nylonnetzfilter in neu etikettierte 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis.
9. Schleudern Sie die Suspension der Gehirnzellen bei 740 x g (max. RCF) für 20 Minuten bei 4 °C herunter, um ein einzelliges Pellet zu erhalten (Abbildung 1B). Nachdem Sie die 15-ml-Röhrchen aus der Zentrifuge genommen haben, legen Sie sie auf Eis und erhöhen Sie die Temperatureinstellung an der Zentrifuge auf ca. 21 °C, um den nächsten Schritt vorzubereiten.
10. Entfernen Sie den Überstand vollständig aus jedem Röhrchen mit Gehirnzellen und resuspendieren Sie die Pellets zunächst in 1 ml Zentrifugationsmedium mit 70 % Dichte mit einer P-1000-Mikropipette. Geben Sie dann mit einer serologischen 10-ml-Pipette 4 weitere Milliliter Zentrifugationsmedium mit einer Dichte von 70 % in jedes Röhrchen. Schrauben Sie die Kappen fest auf und homogenisieren Sie die Zellsuspension, indem Sie sie mehrmals vorsichtig in die Röhrchen umdrehen.
11. Nehmen Sie die 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit Gehirnzellen, die in Zentrifugationsmedien mit 70 % Dichte resuspendiert sind, aus dem Eis und legen Sie sie in ein Reagenzglasgestell bei RT. Lagern Sie nacheinander vorsichtig 2 ml Zentrifugationsmedienlösung mit 37 % Dichte mit einer P-1000-Mikropipette auf die 5 ml Zentrifugationsmedien mit 70 % Dichte, um eine saubere Grenzfläche zwischen den beiden Zentrifugationsmedienschichten zu bilden (Abbildung 1C).
    1. Verwenden Sie einen Marker mit feiner Spitze, um die Position der Grenzfläche anzuzeigen, damit sie nach der Zentrifugation leicht identifiziert werden kann, wenn die Unterscheidung weniger offensichtlich wird.
12. Drehen Sie die 15-ml-Zentrifugenröhrchen bei 740 x g (max. RCF) 20 Minuten lang bei RT ohne Pause herunter, um eine Unterbrechung der Grenzfläche zu vermeiden.
13. Sammeln Sie nach der Zentrifugation die PBMCs, die sich an der Grenzfläche zwischen den beiden Dichtezentrifugationsmedienschichten angesammelt haben (Abbildung 1D), indem Sie eine P-200-Mikropipette entlang der Seite in das Röhrchen einführen und die Lipidschicht vorsichtig umgehen.
    1. Auf der Höhe der PBMC-Bande werden langsam 200 μl von der Oberfläche der Zentrifugationsmedienschicht mit 70 % Dichte extrahiert und in ein entsprechend beschriftetes Polypropylen-FACS-Röhrchen auf Eis gegeben. Wiederholen Sie dies einmal für ein Gesamtvolumen von 400 μl pro Probe.
14. Geben Sie 3 ml Durchflusspuffer in jedes FACS-Röhrchen mit 400 μl PBMCs, um das Dichtezentrifugationsmedium ausreichend zu verdünnen, und schleudern Sie die Zellen dann 20 Minuten lang bei 4 °C bei 660 x g (max. RCF).

Ergebnisse

Abbildung 1: Isolierung von Gliom-infiltrierenden PBMCs. (A) Strategie für die Dissektion von Hirngewebe von Mäusen, das orthotope Gliomimplantate im Frühstadium enthält. Das obere Bild zeigt die sagittale Bisektion der ipsilateralen Hemisphäre weg von der kontralateralen Hemisphäre. Das untere Bild zeigt die beiden zusätzlichen koronalen Schnitte, die notwendig sind, um das Zielg...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbeccos Modifikation von Eagles Medium	Gibco	Artikel-Nr.: 12430-054	Mit 4,5g/L D-Glucose, L-Glutamin, 25mM HEPES und Phenolrot
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Gibco	Nr. 14190-144	Ohne Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid
Fötales Rinderserum	Omega Scientific Inc.	FB-11
Penicillin Streptomycin	Gibco	Nr. 15140-122	10.000 U/ml Penicillin; 10.000 μg/ml Streptomycin
0,6 ml konische Mikroröhrchen aus Polypropylenämie	Genesee Scientific	Nr. 22-272
Eiskübel aus Polyurethan	Fisherbrand	Tel.: 02-591-45	Kapazität: 0,152 oz. (4,5 l)
Kollagenase (Typ I-S)	Sigma Aldrich	Um 1639	Aus Clostridium histolyticum
Desoxyribonuklease I	Worthington Biochemical Corp.	LS002007	>2.000 Kunitz-Einheiten pro mg Trockengewicht
Große Präparierschere	Ted Pella Inc.	Nr. 1316
Kleine Präparierschere	FST	Nr. 14094-11
Zange mit stumpfem Ende	Ted Pella Inc.	Artikel-Nr.: 13250
7ml Glas Dounce Taschentuchmühle	Kontes	KT885300-0007
Percoll Dichte-Zentrifugationsmedien	GE Gesundheitswesen	GE17-0891-01
10 mL serologische Pipetten	Genesee Scientific	Nr. 12-104	Einmalgebrauch; steril
70 μm sterile Zellsiebe aus Nylonnetz	Fisherbrand	22363548
15 ml Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen	Genesee Scientific	Nr. 21-103	Konischer Boden
50 ml Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen	Genesee Scientific	Nr. 21-108	Konischer Boden
12 x 75 mm FACS-Röhrchen aus Polypropylen mit rundem Boden	Fisherbrand	14-956-1B