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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung von Instrumenten, Nährmedien und Schalen
- Bereiten Sie zwei Labor-Präparierscheren aus Edelstahl und zwei Laborzangen aus Edelstahl vor. Autoklavieren Sie alle Instrumente und legen Sie sie zur Sterilisation unter ultraviolettem Licht (UV) in eine Kulturhaube.
- Stellen Sie mindestens 500 ml MEM-Kulturmedium (10 % fötales Kälberserum [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 30 mM D-Glucose, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 6 μg/ml Ampicillin her) und sterilisieren Sie den Filter. Monatelang bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie 24-Well-Kulturplatten mit 14 mm Deckgläsern mit der Dicke Nummer 1 vor. Autoklavieren Sie die Deckgläser und beschichten Sie sie mit 100 mg/l Poly-D-Lysin (PDL). UV-Licht sterilisiert O/N.
>2. Herstellung von Kulturlösungen für zerebelläre Körnerzellen (CGC)
- Bereiten Sie "Lösung A" (100 ml) in autoklaviertem, UV-lichtbehandeltem, sterilem dH2O vor, das 250 mg Glukose, 300 mg Rinderserumalbumin [BSA], 955 mg phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS] (Ca2+ und Mg+ frei) und 1 ml 3,8 % MgSO4,7H 2O enthält.
- "Lösung B" (10 ml) wird hergestellt und enthält 1 ml 5 mg/ml Trypsin, verdünnt in 9 ml Lösung A.
- "Lösung C" (10 ml) mit 1.000 Einheiten DNase, 0,5 mg Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, 100 μl 3,8 % MgSO4,7H 2O, verdünnt auf 10 ml mit Lösung A herstellen.
- "Lösung D" (20 ml) mit 3,2 ml Lösung C, verdünnt auf 20 ml mit Lösung A, herstellen.
- Bereiten Sie BSA/Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Lösung vor, die EBSS, 25 mM NaHCO3, 3 mM MgSO4,7H 2O und 4 % BSA, pH 7,4 enthält.
- Bereiten Sie L-Leucinmethylester (LME) vor, indem Sie reines LME in 5 ml MEM-Kulturmedium geben, um eine Endkonzentration von 150 mM LME zu erhalten, bringen Sie die Lösung mit einem Tisch-pH-Messgerät wieder auf pH 7,4 und sterilisieren Sie sie mit einem 28-mm-Polyethersulfon (PES)-Spritzenvorsatzfilter mit 0,2 μm.
>3. Kultivierung der CGCs
- Sammle Cerebella von 4-7 Tage alten Rattenwelpen. Sofort in eine Petrischale mit 5 ml Lösung A auf Eis geben.
- Gießen Sie die überschüssige Lösung aus dem Kleinhirn ab und legen Sie das Taschentuch in den Deckel der Petrischale.
- Hacken Sie das Taschentuch mit einer gut geflammten Rasierklinge in mindestens drei verschiedene Richtungen fein.
- Geben Sie gehacktes Gewebe zu Lösung B (spülen Sie die Petrischale mit einer Lösung aus, um sicherzustellen, dass nur begrenztes Gewebe verloren geht) und legen Sie es für 5 Minuten bei 37 °C in das Wasserbad. Alle paar Minuten leicht schütteln.
- Lösung D (20 ml) in das Röhrchen geben, um das Trypsin zu neutralisieren, schütteln und bei 65 x g für 5 min zentrifugieren.
- Überstand abgießen.
- In 4 ml Lösung C resuspendieren. Mit drei geflammten Glaspipetten mit abnehmendem Durchmesser gut (jeweils etwa 10 mal) trituieren, bis die Suspension so homogen wie möglich ist.
- Geben Sie langsam und vorsichtig einige Tropfen dieses Homogenats auf das BSA/EBSS. Wenn es anfängt, durch das BSA/EBSS zu sinken, verreiben Sie mehr und/oder fügen Sie etwas mehr Lösung C hinzu. Das Homogenat sollte in einer Schicht auf dem BSA/EBSS liegen. Nicht schütteln. Bei 100 x g 5 min schleudern.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet (weich) in 1 ml MEM-Medium.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und einer Platte mit 800.000 Zellen/Deckglas in 500 μl MEM-Medium. In einen Inkubator bei 37 °C mit 6 % CO2 stellen.
- Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag (24-36 Stunden nach der Vorbereitung). Stellen Sie eine Lösung aus MEM-Medium her, die 10 μM des Zellzyklushemmers Arabinofuranosylcytidin (AraC) enthält.
- Für jedes Deckglas werden 250 μl des alten Mediums in einer frischen 24-Well-Platte aufbewahrt, der Rest aspiriert, 250 μl normales MEM-Medium hinzugefügt und zum Waschen der Zellen abgesaugt. Geben Sie dann die 250 μl altes Medium zurück in die Zellen und füllen Sie es mit 250 μl AraC-haltigem Medium auf.
Anmerkung: Zellen können ab 6 Tagen in vitro (DIV) verwendet werden.
>4. Selektive Depletierung der Mikroglia (durchgeführt bei 6 DIV)
- Reine LME wird zu 5 ml eines separaten Aliquots des MEM-Mediums gegeben, um eine Endkonzentration von 150 mM LME zu erhalten.
- Die Lösung wieder auf einen pH-Wert von 7,4 bringen und mit einem 28 mm Polyethersulfon (PES) 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter sterilisieren.
- Die Lösung auf eine Konzentration von 50 mM (2 x LME) in MEM-Medium verdünnen und zusammen mit normalem MEM-Medium für Kontrollkulturen 10 Minuten lang bei 37 oC in ein Wasserbad stellen.
- Die Hälfte (250 μl) des MEM-Mediums aus CGC-Kulturen entfernen und bei 37 °C aufbewahren.
- Behandeln Sie die Zellen mit MEM-Medium, das 2 x LME (250 μl) enthält, d. h. 1:1 verdünnt mit einer Well-Konzentration von 25 mM, oder mit vorgewärmtem MEM-Medium ohne LME (250 μl) für Kontrollkulturen.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 6 % CO2 für 1 Stunde.
- Waschen Sie die Zellen zweimal in frischem, vorgewärmtem Medium, um LME-haltige Medien zu entfernen, und geben Sie dann das zurückgehaltene Kulturmedium und ein gleiches Volumen frisches, vorgewärmtes MEM-Medium in die entsprechenden Vertiefungen um.
- Die Kulturen werden wieder in den Inkubator gestellt (befeuchtet mit 6 % CO2 bei 37 °C) und vor jeder weiteren Behandlung 24 Stunden ruhen lassen.