Das Protokoll für die Entnahme von Hirngewebe von Tag 1 Sprague Dawley Rattenwelpen, die durch Enthauptung eingeschläfert wurden, wurde vom Animal Care and Use Committee an der Universität von Alberta genehmigt.
>1. Isolierung von Mikroglia und Astrozyten
HINWEIS: Alle Medien für die Isolierung und Zellkultur werden in einem Wasserbad auf 37 °C vorgewärmt. Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS) enthält 1 % Penicillin-Streptomycin (PS). Alle modifizierten Eagle-Medien von Dulbecco mit der F12-Nährstoffmischung von Ham (DMEM/F12) werden mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (PS) ergänzt. Nur Mischungen mit Trypsin fehlen FBS. Alle Materialien in diesem Protokoll sind steril (Filter, Alkohol, gekauft und autoklaviert) und jeder Schritt nach Schritt Nummer 1.8 wird in einer Biosicherheitswerkbank mit aseptischer Technik durchgeführt.
- Pro Gehirn werden 15 ml HBSS und 12,5 ml DMEM/F12 in konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen auf 37 °C und ca. 2 ml 0,25 % Trypsin mit 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen vorerhitzt. Erhitzen Sie weitere 25 mL DMEM/F12. Warmes Trypsin etwa 10 Minuten vor der Anwendung, um einen Verlust der enzymatischen Aktivität zu vermeiden.
- Gießen Sie so viel warmes HBSS in sterile, 6 und 10 cm große Kulturschalen, dass die Oberfläche bedeckt ist. Bereiten Sie eine 10-cm-Schale für jeweils zwei Gehirne plus eine zusätzliche 6-cm-Schale zu.
- Platzieren Sie bis zu 2 Gehirne in jede 10 cm2 Schale (Abbildung 1A).
- Verwenden Sie unter einem Präpariermikroskop eine gekrümmte und gerade Pinzette, um die Kortikale entlang der Mittellinie und das Kleinhirn mit dem Hirnstamm zu trennen. Dies ergibt drei Gewebeabschnitte pro Gehirn (Abbildung 1B).
- Schälen Sie die dünne, halbtransparente Gewebeschicht (Hirnhäute), die Blutgefäße enthält, aus jedem Gewebeabschnitt, entsorgen Sie sie und geben Sie das restliche Gewebe in eine separate Kulturschale. Fassen Sie mit der Pinzette die dünnen Schichten, die durch die Gewebeschnitte freigelegt werden, und ziehen Sie vorsichtig, bis große Teile vom Hirngewebe "abhängen". Entfernen Sie diesen Teil abschließend durch leichtes Ziehen. In Abbildung 1C-1E finden Sie repräsentative Bilder vor, während und nach diesem Schritt.
- Entfernen Sie in einer Biosicherheitswerkbank das restliche HBSS aus der Kulturschale und bewahren Sie das Gewebe vorsichtig auf. Mazerieren Sie das Gewebe mit einem Skalpell und geben Sie das Gewebe mit Trypsin in das vorgewärmte 15-ml-Röhrchen.
- Inkubieren Sie dieses Röhrchen für 25 min in einem 37 °C Bad, um das Gewebe enzymatisch zu verdauen.
- Das Röhrchen wird bei 500 x g 2 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand wird ausgegossen.
- Mit einer serologischen 10-ml-Pipette 10 ml warmes DMEM/F12 hinzufügen, um das Trypsin zu inaktivieren, und die Lösung 5 Mal verreiben, um das Gewebe aufzubrechen.
- Das Röhrchen wird bei 500 x g 2 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand wird ausgegossen.
Mit - einer serologischen 10-ml-Pipette das Pellet in 10 mL warmes DMEM/F12 resuspendieren und die Lösung in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
- Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel und zerreiben Sie die Lösung 3 Mal.
- Verteilen Sie diese Lösung in Schritten von 12,5 ml warmem DMEM/F12 pro Gehirn.
- Pipettieren Sie 1 ml der verreibten Lösung in eine 12-Well-Platte (1 pro Gehirn).
- Inkubieren bei 37 °C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie die Medien nach drei Tagen, und aktualisieren Sie die Medien alle folgenden drei Tage. Nach 2 Wochen können die Zellen für Experimente entnommen werden.
>2. Makromer-Synthese
- Wiegen Sie 375 mg Hyaluronsäure (HA)-Salz in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 37,5 mL destilliertes Wasser hinzu.
- Spülen Sie die Lösung 1 Minute lang mit einem Wirbel und beschallen Sie die Mischung, bis sie homogen erscheint und ihre gelartige Viskosität verliert. Dieser Vorgang kann 6 h dauern.
- Die Lösung in ein 100-ml-Becherglas mit einem magnetischen Rührstab (38 mm) geben und bei Raumtemperatur kräftig umrühren.
- Titrieren Sie vorsichtig 5,0 M NaOH in das Misch-HA und messen Sie mit pH-Papier, bis sich der pH-Wert zwischen 8 und 12 stabilisiert hat.
- Sammeln Sie 3 ml frisches Methacrylanhydrid (MA, 94%), das während der Lagerung mit Stickstoff bedeckt ist.
Anmerkung: MA ist über lange Zeiträume (Tage) der Atmosphäre ausgesetzt und verliert seine Reaktivität.
Vorsicht: Die gesamte Verwendung von MA sollte in einem Abzug erfolgen.
- Geben Sie 200 μl MA in die Mischlösung HA. Die Reaktion senkt den pH-Wert der Lösung auf unter 8.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.4 bis 2.6, bis die 3 ml MA zur Lösung hinzugefügt wurden. Dieser Vorgang kann bis zu 1-2 h dauern.
- Lassen Sie die Reaktion über Nacht bei 4 °C ohne Vermischung weitergehen.
- Die Lösung in ein 500 mL Becherglas mit 400 mL kaltem Ethanol (EtOH) überführen und 24 - 72 h bei 4 °C ausfällen lassen.
- Der größte Teil der Lösung wird zur Entsorgung vorsichtig in ein separates Becherglas umgefüllt und der Niederschlag in einem konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen aufgefangen. Diese kann bei Bedarf in 2-4 Röhrchen verteilt werden.
- Die Röhrchen bei 200 x g in einer Zentrifuge für 2 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
- Füllen Sie das Röhrchen mit kaltem EtOH auf, mischen Sie die Lösung 1 Minute lang mit einem Vortexer und wiederholen Sie Schritt 2.10-2.11.
- Fügen Sie 25 ml steriles deionisiertes Wasser hinzu, mischen Sie die Lösung 1 Minute lang mit einem Vortexer, beschallen Sie sie 1 h lang (>20 kHz) und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.
- Die Lösung für 15 min in einen -80 °C Gefrierschrank legen oder bis sie in flüssigem Stickstoff gefroren oder schockgefroren ist.
Vorsicht: Wenn Sie flüssigen Stickstoff verwenden, verwenden Sie Schutzhandschuhe, einen Gesichtsschutz und eine Schürze.
- Gefriertrocknen Sie das Rohr (unter 0,1 mBar und -30 °C) für 24 - 48 h, bis ein schneeartiges Pulver entsteht.
- Zu diesem Zeitpunkt wird die Probe mittels 1-H-Kernspinresonanz auf Reinheit getestet, wobei die Menge an Methacrylat-Protonen (Spitzenwerte bei 6,1 und 5,6 ppm) im Verhältnis zu Methylprotonen (1,9 ppm) auf dem HA-Rückgrat bestätigt werden kann. Ein Mindestverhältnis von 95 % Methacrylat zu Methylprotonen ist akzeptabel.
>3. Gelbildung und 3D-Verkapselung
- Deckglas und Formvorbereitung
- Stellen Sie eine 50-ml-Lösung aus destilliertem Wasser aus 2%igem 3-(Trimethoxysilyl)-propylmethacrylat in einem konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen her.
- 18 mm Glasdeckgläser in Lösung legen und 1 h bei Raumtemperatur wiegen. Es können bis zu 50 Deckgläser auf einmal hinzugefügt werden.
Spülen Sie - die Deckgläser, indem Sie jedes nacheinander in 3 Bechergläser mit 100 mL deionisiertem Wasser tauchen.
- Trocknen Sie die Deckgläser im Vakuum bei 40 °C über Nacht mit einem Exsikkator und einem Ofen.
- Einzelne Deckgläser schnell mit einer Pinzette in 70% EtOH tauchen.
- Lassen Sie jedes Deckglas ohne Trocknen in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte fallen.
- Waschen und aspirieren Sie jede Vertiefung mit sterilem entionisiertem Wasser (1 ml pro Vertiefung).
- 1 ml steriles 2 μg/ml Poly-L-Lysin (PLL) in jede Vertiefung geben und >2 h inkubieren.
- Saugen Sie die PLL-Lösung an und lassen Sie die Deckgläser an der Luft trocknen.
- Tauchen Sie Polydimethylsiloxan (PDMS)-Formen (siehe Abbildung 2) in 70 % EtOH und legen Sie eine auf die Mitte jedes Deckglases, lassen Sie sie an der Luft trocknen und schaffen Sie eine Abdichtung zwischen der Form und dem Glas.
- Bereiten Sie PDMS-Formen vor, indem Sie PDMS-Premix-Reagenzien im Verhältnis 10:1 in eine Polystyrolschale mit flachem Boden gießen. Die Menge des vorbereiteten PDMS wird so gewählt, dass ein Blech mit einer Dicke von ca. 1 mm entsteht. Um Vertiefungen im PDMS zu bilden, schneiden Sie die Bleche mit einem Kreisstempel mit einem Innendurchmesser von 10 ab.
- Zellvorbereitung
HINWEIS: Alle Schritte des Protokolls werden mit steriler Technik in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt. Die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wird in allen Schritten auf pH 7,4 eingestellt.
- 24 h vor der Zellverkapselung in methacrylierter Hyaluronsäure (HAMA) frischen Sie das Medium für die 2-wöchigen Primärkulturen (aus Schritt 1.15) in den 12-Well-Platten auf. Fügen Sie 1 ml DMEM/F12 (10 % FBS und 1 % PS) Medium pro Vertiefung hinzu.
- Für jede 12-Well-Zellplatte werden 12,5 ml verdünntes Trypsin (0,25 % Trypsin-EDTA, 30 % mit DMEM/F12-Medien verdünnt) und 25 ml DMEM/F12 (10 % FBS und 1 % PS) hergestellt und bei 37 °C im Wasserbad erwärmt.
- Sammeln Sie konditioniertes Medium mit einer serologischen 10-ml-Pipette (> 0,5 mL pro Well) von den Platten, aspirieren Sie die restliche Flüssigkeit gründlich und ersetzen Sie es durch 1 mL pro Well verdünntes Trypsin (0,075 % Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]) für 20-30 Minuten in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO2), bis sich die konfluente Zellschicht von der Platte löst.
- Gewinnen Sie suspendiertes Zellmaterial mit einer 1-ml-Pipette (erscheint als einzelnes schwimmendes Stück) und sammeln Sie es in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Mit einem äquivalenten Volumen von DMEM/F12 (10 % FBS und 1 % PS) verdünnen und 2 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 200 x g zentrifugieren, wobei der Überstand verworfen wird.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 mL warmem DMEM/F12 (10 % FBS und 1 % PS), zerreiben Sie die Zellen 5 Mal mit einer 10 mL Pipette und zentrifugieren Sie es 2 min lang bei 200 x g.
- Dekantieren Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 5 mL warmem DMEM/F12 und überführen Sie die Zellen in ein konisches 50 mL Zentrifugenröhrchen.
- Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel, zerreiben Sie die Zelllösung 3-mal und filtrieren Sie die Suspension durch ein 40-μm-Zellsieb in ein neues konisches Zentrifugenröhrchen.
- Sammeln Sie 10 μl Zellsuspension, verdünnen Sie sie 1:100 in warmem DMEM/F12 und zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler.
- In einem 37 °C warmen Wasserbad bis zur Verkapselung inkubieren.
- Zellverkapselung
HINWEIS: Alle Schritte des Protokolls werden mit steriler Technik in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt.
- Für jede 12-Well-Platte mit 3D-Hydrogelen werden 12,5 ml DMEM/F12 und 12,5 ml des konditionierten DMEM/F12-Mediums erwärmt, das während der Zellvorbereitung gesammelt wurde.
- Wiegen Sie die Menge an HAMA, die für eine Endkonzentration von 0,5 Gew.-% / vol erforderlich ist. Löse dieses HAMA in steril filtriertem PBS in einer Konzentration von (2 Gew.-% / vol) auf. Eine Konzentration, die 4-mal höher ist als die Endkonzentration, wird verwendet, um die Zugabe von Zellen und anderen Reagenzien zu ermöglichen. Eine 12-Well-Platte mit Hydrogelen benötigt ~350 μl PBS mit 7 mg HAMA.
- Beschallen Sie die Lösungen (>20 kHz), bis HAMA 60 Minuten lang vollständig aufgelöst ist.
- Bereiten Sie einzelne 10%ige Lösungen von Triethanolamin (TEA) und 1-Vinyl-2-pyrrolidinon (NVP) und eine 1 mM Lösung von Eosin Y (EY) in 1 ml Aliquoten von sterilem PBS pH 7,4 vor.
- Für eine 12-Well-Platte wird eine abschließende 1,4-ml-Mischung aus 1 x 107 Zellen, 0,5 Gew.-% HAMA (350 μl von 2 Gew.-/Vol.), 0,1 % TEA (14 μl von 10 %), 0,1 % NVP (14 μl von 10 %) und 0,01 mM EY (14 μl von 1 mM) und 20 % basaler Lamina-Mischung (280 μl Stamm) hergestellt. Das verbleibende Volumen ist PBS.
- Mischen Sie die Lösung vorsichtig und pipettieren Sie 100 μl mit einer 1-ml-Spitze in jede PDMS-Form.
- Die Proben werden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur einem hochintensiven grünen LED-Licht (~520 nm, 60 mW, in einer geschlossenen Box von 20 cm x 20 cm x 20 cm) ausgesetzt.
- Geben Sie 1 ml warmkonditioniertes DMEM/F12 pro Vertiefung in eine 12-Well-Platte.
- Fassen Sie jedes Deckglas zwischen Daumen und Zeigefinger, ziehen Sie die PDMS-Form langsam mit einer gebogenen Pinzette ab, achten Sie darauf, das Gel nicht zu verschieben, und geben Sie es in eine Vertiefung mit konditioniertem Medium.
- Geben Sie zusätzlich 1 mL warmes DMEM/F12 in jede Vertiefung
.
- Inkubieren Sie die Platten 2 Wochen lang bei 37 °C mit 5 % CO2 und erneuern Sie die Zellmedien jede Woche, indem Sie 1 ml Medium aus jeder Vertiefung pipettieren und durch 1 ml DMEM/F12 ersetzen.
