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>1. Zellkultur und Reagenzienvorbereitung
- Bereiten Sie beschichtete Platten für die Zellkultur vor.
- Verdünnen Sie die Beschichtungslösung mit extrazellulärer Matrix (ECM) mit DMEM/F12-Medien, um eine 1 mg/ml-Stammlösung herzustellen. Die verdünnte ECM-Stammlösung wird in 30 konische Röhrchen zu je 3 ml aliquotiert und sofort bei -20 °C gelagert. Um eine Arbeitslösung zu erhalten, resuspendieren Sie 3 mL ECM-Material in 33 mL vorgekühltes DMEM/F12-Medium, wodurch das Gesamtvolumen auf 36 mL für eine Konzentration von 80 μg/mL gebracht wird.
- Beschichten Sie 1 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturplatte mit ECM-Arbeitslösung. Fügen Sie bei Bedarf zusätzlich 1 ml DMEM/F12 pro Vertiefung hinzu, um sicherzustellen, dass die Oberfläche der Vertiefung vollständig bedeckt ist. Lassen Sie die beschichteten 6-Well-Zellkulturplatten vor der Verwendung mindestens 1 h bei Raumtemperatur ruhen.
HINWEIS: Beschichtete Platten können bis zu 2 Wochen im Inkubator oder bei 4 °C gelagert werden.
- Bereiten Sie Medienformulierungen, Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle vor.
- Zur Herstellung von 500 ml humanem pluripotentem Stammzellmedium (hPSC) fügen Sie 20x und 500x Supplemente gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu.
- Zur Herstellung von 500 ml neuronalem Medium (NM) fügen Sie Heparin in einer Endkonzentration von 2 mg/ml, 1x Antibiotikum/Antimykotikum, 1x B27-Supplement oder 1x N2-Supplement in eine 500 mL Flasche DMEM/F12 mit L-Glutamin-Supplement hinzu, wie zuvor beschrieben.
- Zur Herstellung einer 10 mM (1.000x) Stammlösung des Rho-Kinase-Inhibitors Y27632 (Y) fügen Sie 10 mg Pulver in 3 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu. Filtrieren, sterilisieren, aliquotieren und bei -20 °C lagern. Bei einer Arbeitskonzentration von 10 μM in Medien verwenden.
- Zur Herstellung einer 20 mM (10.000x) Stammlösung von SB431542 fügen Sie 10 mg Pulver in 1,3 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzu. Zur Herstellung einer 2 mM (1.000x) Stammlösung von DMH1 fügen Sie 10 mg Pulver in 13,1 ml DMSO hinzu. Filtrieren, sterilisieren, aliquotieren und lagern Sie jede Lösung bei -20 °C. Verwenden Sie jede Lösung bei einer Arbeitskonzentration von 2 μM in Medien (NM + SB431542 + DMH1).
Anmerkung: Dieses Protokoll empfiehlt Arbeitskonzentrationen von 2 μM sowohl von SB431542 als auch von DMH1, basierend auf unseren Beobachtungen und Berichten von anderen, die besagen, dass diese Konzentration die neuronale Induktion von hPSCs effektiv fördert. Es wurden auch höhere Konzentrationen gemeldet30. Darüber hinaus wurde mit alternativen Medien auch gezeigt, dass kleine Moleküle für eine hohe neuronale Umwandlung nicht notwendig sind. Daher variieren die Arbeitskonzentrationen je nach alternativer Zellkulturumgebung, und die optimalen Konzentrationen sollten von einzelnen Forschern getestet werden.
- Zur Herstellung einzelner 100 μg/ml (10.000x) Stammlösungen des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) und des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF2) fügen Sie jeweils 1 mg in 10 ml PBS + 0,1 % BSA hinzu. Stammlösungen von EGF und FGF2 in 50 μl Aliquote abfüllen und bei -80 ΰC lagern. jeweils bei einer Arbeitskonzentration von 10 ng/ml in Medien verwenden; Fügen Sie z. B. 5 μL EGF und 5 μL FGF2 zu 50 mL NM (NM + EGF + FGF2) hinzu.
- Zur Herstellung einer Stammlösung aus Doxycyclinhydrochlorid (Dox) wird das Pulver zunächst in DMSO auf 100 mg/ml aufgelöst und bei -20 °C gelagert. Verdünnen Sie es weiter, um eine 2 mg/ml (1.000x) Stammlösung in PBS herzustellen, und lagern Sie es bei -20 °C. Verwenden Sie es bei einer Arbeitskonzentration von 2 μg/ml in Medien; Fügen Sie z. B. 50 μL Dox zu 50 mL NM (NM + Dox) hinzu.
Anmerkung: Frieren Sie die Lösungen nach dem Auftauen nicht wieder ein.
>2. Erzeugung neuronaler Subtypen aus humanen induzierten pluripotenten Zellen (hPSCs)
HINWEIS: Alle Zellkulturen sollten in einem Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C aufbewahrt werden. Diese Kulturen werden auf einem Sauerstoffgehalt im Raum gehalten, obwohl niedrigere Werte verwendet werden können.
- Erzeugung und Pflege von Astrozyten-Vorläuferzellen (hAstros) aus hPSCs.
Anmerkung: Dieser Abschnitt enthält ein kurzes und vereinfachtes Differenzierungsprotokoll. Eine detaillierte Beschreibung (mit Embryoidkörperbildung, Rosettenauswahl und regionalen Strukturierungsschritten) finden Sie im zuvor beschriebenen Protokoll (Abbildung 1A, gestrichelter grüner Kasten).
- Seed-Cluster von hPSCs (Abbildung 1B) auf ECM-beschichtete 6-Well-Platten (siehe Schritt 1.1) mit 2 mL hPSC-Medium + Y pro Well. Füttern Sie die Stammzellen jeden Tag, bis sie zu etwa 50 % zusammenfließen und nach Bedarf gespalten sind.
- Um hPSCs zu spalten, geben Sie 1 ml Pässeagenzreagenz in die Vertiefungen und aspirieren Sie nach 1 Minute. Inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, fügen Sie 1 ml hPSC-Medium hinzu und teilen Sie die Aggregate 1:10 auf neue ECM-beschichtete Vertiefungen in 2 ml hPSC-Medium + Y pro Vertiefung auf.
- Pflegen Sie die Stammzellen, bis sie zu etwa 50 % konfluiert sind, und wechseln Sie dann das Medium zu NM + SB431542 + DMH1, um die neuronale Differenzierung zu induzieren (Tag 0). Wenn die Zellen zu etwa 95 % konfluiert sind, teilen Sie sie 1:6 in neue EZM-beschichtete Vertiefungen im selben Medium auf.
- Am 14. Tag werden die Zellen mit der Ablöselösung dissoziiert und in einen unbeschichteten Kolben mit Y überführt, um die Bildung von Aggregaten zu fördern.
Anmerkung: Die Zugabe von Y wird verwendet, um das Überleben der Zellen und die Kugelbildung zu fördern, ist aber nicht bei jeder Fütterung enthalten.
- Für die Erzeugung von neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen (hNeuronen) verwenden Sie diese Tag-14-Zellen wie unten beschrieben. Alternativ können diese Zellen zu einem späteren Zeitpunkt aus Monolayer- oder Kugelkulturen verwendet werden, bevor die neuronale Reifung stattfindet oder die Gliogenese beginnt.
Anmerkung: Standardmäßig produziert dieses Protokoll dorsal-kortikale Astrozyten. Astrozyten-Subtypen können jedoch auf Wunsch durch Zugabe von Mustermorphogenen regional spezifiziert werden. Retinsäure (RA) kann zugesetzt werden, um Zellen in Rückenmarksphänotypen zu kaudalisieren, während Sonic Hedgehog (SHH), geglätteter Agonist (SAG) oder Purmorphamin ventrale Phänotypen erzeugen.
- Für die Erzeugung von Astrozyten-Vorläuferzellen und Astrozyten in spontan gebildeten 3D-Aggregaten (hAstrosphären) wechseln Sie zu NM + EGF + FGF2 und füttern Sie wöchentlich (oder nach Bedarf, um einen stabilen pH-Wert zu gewährleisten), wie zuvor beschrieben.
- Dissoziieren Sie hAstro-Aggregate sanft mit Ablösung, wenn dunkle Zentren auftreten, und entfernen Sie Kugeln, die sich spontan anlagern. Brechen Sie die Kugeln einmal pro Woche sanft, um die Gesundheit der Kugeln zu erhalten und nekrotische Kerne zu vermeiden.
Anmerkung: Überschreiten Sie nicht 5 Minuten der Behandlung mit Ablöselösung.
- Nach 4-6 Monaten der Expansion bestätigen Sie die Zellidentität und frieren Sie sie entweder in Kryokonservierungsmedium (gemäß den Anweisungen des Herstellers) oder unter alternativen Lagerbedingungen für die Langzeitkonservierung in flüssigem Stickstoff ein oder verwenden Sie sie sofort für Experimente.
