Generierung von 3D-Co-Kultursphären von Astrozyten und Neuronen zur Induktion der Synapsenbildung

Zusammenfassung

Quelle: Cvetkovic, C., et al. Synaptische Mikroschaltkreismodellierung mit 3D-Kokulturen von Astrozyten und Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur gemeinsamen Kultivierung von Astrozyten und Neuronen, um 3D-Kugeln zu bilden. Diese 3D-Sphären bieten eine eigenständige Plattform für die Untersuchung der Synapsenbildung und der Integration neuronaler Netzwerke und dienen damit als potenzielles Modell für die Forschung in den Entwicklungsneurowissenschaften, neurodegenerativen Erkrankungen und neuropharmakologischen Interventionen.

Protokoll

>1. Vorbereitung und Pflege von 3D-Kugel-Kokulturen

1. Trennen Sie hAstros von 3D-Aggregaten in Suspension.​
   1. Dissoziieren Sie humane Astrozyten-Aggregate (hAstro) vorsichtig mit Ablösung, wenn dunkle Zentren auftreten, und entfernen Sie Kugeln, die sich spontan anlagern. Brechen Sie die Kugeln einmal pro Woche sanft, um die Gesundheit der Kugeln zu erhalten und nekrotische Kerne zu vermeiden.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 5 Minuten der Behandlung mit Ablöselösung.
2. Dissoziieren Sie hNeuronen oder iNeuronen von einer 2D-Monoschicht.
   1. Entf....

Ergebnisse

Abbildung 1: Systematische und reproduzierbare Erzeugung von biotechnologisch hergestellten 3D-Neurosphären. (A) Mikrotiter-Kulturplatten (μ-Well) werden verwendet, um 3D-Neurosphären mit der gewünschten Dichte und dem Verhältnis von Neuronen zu Astrozyten in einer systematischen und benutzerdefinierten Weise zu bilden, was zu einer konsistenten Größe und Form führt. Die Bilder we.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6-Well-Platte	Fisher Scientific	08-772-1B
15 ml konische Röhrchen	Olympus Kunststoffe	Nr. 28-101
Accutase	Sigma	Nr. A6964-100ML	Lösung für die Ablösung
AggreWell-Platte	Stammzellen-Technologien	Artikel-Nr.: 34850
Anti-Adhärenz-Spüllösung	Stammzellen-Technologien	7010	Verhindern Sie die Adhäsion von Zellen an Mikrotiterplatten
Anti/Anti	Thermofischer	15240062
Nr. B27	Thermofischer	17504044	Medienbeilage
BrainPhys neuronales Medium	Stammzellen-Technologien	5790	Neurophysiologische Alternative zum Basalmedium
DMEM/F12	Thermofischer	Artikel-Nr.: 10565-042	Mit GlutaMAX Ergänzung
DMH-1	Stammzellen-Technologien	Artikel-Nr.: 73634	GEFAHR: Giftig beim Verschlucken. Arbeitskonzentration: 2 μm
Esel-Serum	Lampire Biologische Laboratorien	Artikel-Nr.: 7332100	Arbeitskonzentration: 5 % im primären Blockierungspuffer, 1 % im sekundären Blockierungspuffer
Doxycyclinhydrochlorid (Dox)	Sigma	D3072-1ml	GEFAHR: Giftig für Schwangere. Arbeitskonzentration: 2 μg/ml
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Arbeitskonzentration: 10 ng/mL
Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF)	Peprotech	100-18 Mrd.	Arbeitskonzentration: 10 ng/mL
Hämazytometer oder automatischer Zellzähler	Lebenstechnologien	AMQAX1000
Matrigel-Membran-Matrix	Corning	Artikel-Nr.: 354230	ECM-Beschichtungslösung. Arbeitskonzentration: 80 μg/ml. Bereiten Sie auf Eis vor und stellen Sie sicher, dass Pipetten, Röhrchen und Medien vorgekühlt sind.
MEA 2100 System	Mehrkanal-Systeme	MEA2100
Rho-Kinase-Inhibitor Y27632- (Y)	Tocris	Nr. 1254	Arbeitskonzentration: 10 μm
SB431542	Stammzellen-Technologien	Artikel-Nr.: 72234	Arbeitskonzentration: 2 μm
Spinnerkolben	Fisher Scientific	Nr. 4500-125
T25 Kulturflasche	Olympus Kunststoffe	Nr. 25-207	Belüftete Kappen
Trypan-Blau	Invitrogen	Nr. T10282

kg