Generierung von 3D-Co-Kultursphären von Astrozyten und Neuronen zur Induktion der Synapsenbildung

Zusammenfassung

Quelle: Cvetkovic, C., et al. Synaptische Mikroschaltkreismodellierung mit 3D-Kokulturen von Astrozyten und Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur gemeinsamen Kultivierung von Astrozyten und Neuronen, um 3D-Kugeln zu bilden. Diese 3D-Sphären bieten eine eigenständige Plattform für die Untersuchung der Synapsenbildung und der Integration neuronaler Netzwerke und dienen damit als potenzielles Modell für die Forschung in den Entwicklungsneurowissenschaften, neurodegenerativen Erkrankungen und neuropharmakologischen Interventionen.

Protokoll

>1. Vorbereitung und Pflege von 3D-Kugel-Kokulturen

1. Trennen Sie hAstros von 3D-Aggregaten in Suspension.​
   1. Dissoziieren Sie humane Astrozyten-Aggregate (hAstro) vorsichtig mit Ablösung, wenn dunkle Zentren auftreten, und entfernen Sie Kugeln, die sich spontan anlagern. Brechen Sie die Kugeln einmal pro Woche sanft, um die Gesundheit der Kugeln zu erhalten und nekrotische Kerne zu vermeiden.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 5 Minuten der Behandlung mit Ablöselösung.
2. Dissoziieren Sie hNeuronen oder iNeuronen von einer 2D-Monoschicht.
   1. Entfernen Sie das Medium von der 6-Well-Platte und geben Sie 500 μl Ablöselösung zu jeder gut enthaltenden Monolayer-Kultur von hNeuron (menschliches Neuron) oder iNeurons (induzierbare Neuronen). Bei 37 °C 5 min inkubieren. Fügen Sie vorsichtig 2-3 mL DMEM/F12 Basalmedium hinzu, um anhaftende Zellen zu entfernen.
   2. Sammeln Sie Zellen und Medien in einem konischen 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 1 Minute lang bei 300 x g. Aspirieren Sie den Überstand, fügen Sie 1 ml frisches Medium hinzu und pipettieren Sie vorsichtig mit einer 1.000-μl-Mikropipette auf und ab, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
3. Formen Sie 3D-Kugeln mit Mikrotiterplatten.
   1. Bereiten Sie die Platte vor, indem Sie 0,5 ml Anti-Adhärenz-Spüllösung in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte geben. Zentrifugierte Platte bei 2.000 x g für 5 min. Aspirieren Sie die Spüllösung, geben Sie 1 ml DMEM/F12-Basalmedium in jede Vertiefung, um sie zu waschen, und aspirieren Sie erneut.
      Anmerkung: Achten Sie immer darauf, dass die Zentrifuge während des Gebrauchs ausbalanciert ist.
   2. Zählen Sie jeden Zelltyp mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Fügen Sie das gewünschte Verhältnis von dissoziierten hAstros und hNeuronen oder iNeuronen zu jeder Vertiefung in einem Gesamtvolumen von 2 ml neuronalem Medium (NM) + Y hinzu (einschließlich Dox, wenn iNeuronen verwendet werden). Zentrifugieren Sie die Platte bei 100 x g für 3 min und kehren Sie in den Inkubator zurück.
      HINWEIS: 24-Well-Mikrotiterplatten (siehe Materialtabelle) enthalten 300 Mikrowells pro Well. Geben Sie mindestens 6 x 10⁵ Zellen (für Kugeln von je 2 x 10³ Zellen) und maximal 6 x 10⁶ Zellen (für Kugeln von je 2 x 10⁴ Zellen) in 2 ml Medium pro Well. Für lebensfähige Kugeln mit einer bestimmten Dichte innerhalb dieses Bereichs verwenden Sie eine definierte Anzahl von Zellen und dividieren durch 300, um die Anzahl der Zellen pro Kugel zu berechnen. Auf Wunsch können auch alternative kugelbildende Verfahren und Werkzeuge verwendet werden. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für akzeptable Bereiche der Zelldichte.
   3. Lassen Sie die Zellen in den nächsten 2 Tagen in Mikrotiterplatten sich selbst zu dicht gepackten Kugeln zusammensetzen (Abbildung 1A). Ersetzen Sie 50 % des Mediums, wenn die Kultur vergilbt.
      Anmerkung: Wechseln Sie nur die Hälfte des Mediums und pipettieren Sie es vorsichtig beim Entnehmen und Hinzufügen, um die Kugeln nicht zu stören. Kugeln können sich aus Mikrovertiefungen abheben und mit höherer Kraft miteinander verschmelzen.
   4. Entnehmen Sie die Kugeln nach 2 Tagen vorsichtig mit einer 1.000-μl-Mikropipette aus den Mikrovertiefungen (Abbildung 2D). Üben Sie mit dem Medium leicht Kraft auf den Boden der Mikrovertiefungen aus, um zusätzlich anhaftende Kugeln zu entfernen. Lassen Sie die Kugeln in einem konischen 15-ml-Röhrchen absetzen, saugen Sie das alte Medium an und fügen Sie frisches Medium hinzu.
4. Richten Sie das Spinnerkolben-Bioreaktorsystem für die Bildung von 3D-Kugeln ein.​
   1. Reinigen Sie die Oberfläche einer magnetischen Rührplatte mit 70 % Ethanol und legen Sie sie in einen Zellkultur-Inkubator. Autoklavieren Sie einzelne Spinnerkolben zum Sterilisieren.
   2. Fügen Sie Kugeln mit mindestens 50 bis 60 ml Medien zu jedem Spinnerkolben hinzu (Abbildung 2D, Einschub). Stellen Sie den Kolben auf die Magnetrührplatte, die auf 60 U/min eingestellt ist. Kulturkugeln in Spinnerkolben, bis sie für die Datenerfassung bereit sind.
      Anmerkung: Für die Synapsenbildung sind mindestens 3 Wochen in Kultur erforderlich.

Ergebnisse

Abbildung 1: Systematische und reproduzierbare Erzeugung von biotechnologisch hergestellten 3D-Neurosphären. (A) Mikrotiter-Kulturplatten (μ-Well) werden verwendet, um 3D-Neurosphären mit der gewünschten Dichte und dem Verhältnis von Neuronen zu Astrozyten in einer systematischen und benutzerdefinierten Weise zu bilden, was zu einer konsistenten Größe und Form führt. Die Bilder we...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6-Well-Platte	Fisher Scientific	08-772-1B
15 ml konische Röhrchen	Olympus Kunststoffe	Nr. 28-101
Accutase	Sigma	Nr. A6964-100ML	Lösung für die Ablösung
AggreWell-Platte	Stammzellen-Technologien	Artikel-Nr.: 34850
Anti-Adhärenz-Spüllösung	Stammzellen-Technologien	7010	Verhindern Sie die Adhäsion von Zellen an Mikrotiterplatten
Anti/Anti	Thermofischer	15240062
Nr. B27	Thermofischer	17504044	Medienbeilage
BrainPhys neuronales Medium	Stammzellen-Technologien	5790	Neurophysiologische Alternative zum Basalmedium
DMEM/F12	Thermofischer	Artikel-Nr.: 10565-042	Mit GlutaMAX Ergänzung
DMH-1	Stammzellen-Technologien	Artikel-Nr.: 73634	GEFAHR: Giftig beim Verschlucken. Arbeitskonzentration: 2 μm
Esel-Serum	Lampire Biologische Laboratorien	Artikel-Nr.: 7332100	Arbeitskonzentration: 5 % im primären Blockierungspuffer, 1 % im sekundären Blockierungspuffer
Doxycyclinhydrochlorid (Dox)	Sigma	D3072-1ml	GEFAHR: Giftig für Schwangere. Arbeitskonzentration: 2 μg/ml
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Arbeitskonzentration: 10 ng/mL
Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF)	Peprotech	100-18 Mrd.	Arbeitskonzentration: 10 ng/mL
Hämazytometer oder automatischer Zellzähler	Lebenstechnologien	AMQAX1000
Matrigel-Membran-Matrix	Corning	Artikel-Nr.: 354230	ECM-Beschichtungslösung. Arbeitskonzentration: 80 μg/ml. Bereiten Sie auf Eis vor und stellen Sie sicher, dass Pipetten, Röhrchen und Medien vorgekühlt sind.
MEA 2100 System	Mehrkanal-Systeme	MEA2100
Rho-Kinase-Inhibitor Y27632- (Y)	Tocris	Nr. 1254	Arbeitskonzentration: 10 μm
SB431542	Stammzellen-Technologien	Artikel-Nr.: 72234	Arbeitskonzentration: 2 μm
Spinnerkolben	Fisher Scientific	Nr. 4500-125
T25 Kulturflasche	Olympus Kunststoffe	Nr. 25-207	Belüftete Kappen
Trypan-Blau	Invitrogen	Nr. T10282

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