Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung von Ratten-MSC-Kulturen
- Gewinnung von MSCs aus dem Oberschenkelknochen
- Alle Präparierwerkzeuge (d. h. Feinpräparierscheren, Schneidscheren mit stumpfer Spitze und Zahnzangen) vor Gebrauch mindestens 2 Stunden lang bei 180 °C autoklavieren.
- Bereiten Sie ein MSC-Wachstumsmedium vor, das aus minimaler essentieller Medium-Alpha-Modifikation (αMEM) besteht, ergänzt mit 15 % fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin (P/S, 1 % v/v).
- Junge männliche Sprague-Dawley-Ratten (200-250 g Körpergewicht) durch Pentobarbiton-Überdosierung (240 mg/kg Körpergewicht, intraperitoneal) töten.
Anmerkung: Knochenmarkproben von verschiedenen Ratten sollten getrennt verarbeitet werden.
- Lege die getöteten Tiere in Rückenlage. Reinigen Sie den Bauch und die unteren Gliedmaßen gründlich mit 70 % Ethanol.
- Entfernen Sie die Haut und das Unterhautgewebe über den medialen Oberschenkeln mit einer feinen Präparierschere und einer Pinzette. Entferne die Oberschenkelmuskulatur umlaufend, bis der Oberschenkelknochen freiliegt. Setzen Sie dies proximal und distal fort, bis die Knie- und Hüftgelenke zu sehen sind. Den Oberschenkelknochen mit einer stumpfen Schneideschere durch Hüft- und Kniegelenk disartikulieren.
Anmerkung: Durchtrennen Sie den Oberschenkelknochen zu diesem Zeitpunkt nicht, um die Markhöhle freizulegen. Intakte Femure zur weiteren Verarbeitung in eine Laminar-Flow-Gewebekulturhaube überführen.
- Verwenden Sie eine stumpfe Schneideschere, um die distalen und proximalen Enden des Oberschenkelknochens durch die Metaphyse zu durchschneiden.
- Platzieren Sie ein 70-μm-Zellsieb über einem konischen 50-ml-Röhrchen. Eine 21 G, 10 mL Spritze mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4) in den freiliegenden Femurkanal einführen und den Markinhalt durch wiederholtes Spülen in den konischen Schlauch spülen
Anmerkung: Ungefähr 20 ml PBS werden verwendet, um jeden Femur zu spülen. Bleibt die Farbe des gespülten Inhalts blutbefleckt und trüb, kann ein größeres Volumen verwendet werden.
- Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 480 x g für 5 min gesammelt. Den Überstand wird verworfen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 mL MSC-Wachstumsmedium. Verteilen Sie die Zellen auf eine 10 cm große Gewebekulturschale. Stellen Sie die Gewebekulturschalen in einen Zellinkubator (37 °C, 5 % CO2). Erfassen Sie den ersten Tag der Beschichtung als Tag 0,
Anmerkung: Bei allen Zentrifugationsschritten ist die Bremse auf maximale Verzögerung zu stellen.
- Auf- und Ausbau von MSC-Kolonien
Anmerkung: Dieses Protokoll beruht auf der plastischen Adhärenz von Gewebekulturen, um MSCs aus der Knochenmarkhöhle auszuwählen. Der Knochenmarkinhalt darf 2 Tage lang an dem Gewebekulturkunststoff haften.
- Spülen Sie die Kulturplatten an Tag 2 dreimal mit 10 ml PBS, um nicht adhärente Zellen zu entfernen. Ersetzen Sie das PBS nach dem Spülen durch 10 mL MSC-Wachstumsmedium. Waschen Sie die Zellen mit PBS und füllen Sie sie alle 3 Tage mit MSC-Wachstumsmedium auf.
Anmerkung: MSC-Kolonien sollten an Tag 6-7 sichtbar sein (Abbildung 1A).
- Passage der Zellen bis zum 10. Tag, indem Sie das Wachstumsmedium entfernen und die Zellen mit PBS spülen. 1,5 ml rekombinantes enzymatisches Zelldissoziationsreagenz zugeben und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubieren. Fügen Sie 3 ml MSC-Wachstumsmedium hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Die abgelösten Zellen werden durch Zentrifugation bei 250 x g für 5 min gesammelt.
- Quantifizieren Sie die Zellen im Pellet mit einem Hämozytometer nach einer geeigneten Verdünnung in PBS.
- Zellen mit einer Dichte von 40.000 Zellen/cm2 in eine 10 cm große Kulturplatte in einem MSC-Wachstumsmedium ausseeden.
Anmerkung: Die MSC der Ratte sollten innerhalb von 2 Tagen nach der Passage eine Konfluenz von 80-90 % erreichen (Abbildung 1B). Zellen können wie in Schritt 1.2.2 beschrieben für bis zu 8 Durchgänge durchlaufen werden. MSCs können mit Hilfe der Immunzytochemie und ihrer Fähigkeit zur Trilineage-Differenzierung charakterisiert werden (Abbildung 2). Nur MSC-Kulturen zwischen den Passagen 3 und 8 unterliegen einer anschließenden hypoxischen Präkonditionierung und Anreicherung der neuralen Vorläufer. MSCs mit größerer Passagenzahl nehmen eine abgeflachte Morphologie an (Abbildung 1C) und produzieren nicht genügend neuronale Vorläuferzellen. Diese Kulturen sollten verworfen werden.
>2. Vorbereitung von humanen BMSC-Kulturen
- 1 ml menschliches Knochenmarkaspirat mit 9 ml MSC-Wachstumsmedium verdünnen und die Zellen auf einer 10 cm großen Gewebekulturschale plattieren. Bewahren Sie die Kulturen in einem Zellinkubator (37 °C, 5 % CO2) auf.
- Entfernen Sie das Medium nach 2 Tagen und spülen Sie die Kulturen dreimal vorsichtig mit 10 ml PBS aus, um nicht adhärente Zellen zu entfernen. Entfernen Sie nach der letzten Spülung das PBS und ersetzen Sie es durch 10 mL MSC-Wachstumsmedium. Füllen Sie das Wachstumsmedium alle 3 Tage Kultur nach der PBS-Spülung auf.
Anmerkung: MSC-Kolonien sollten an Tag 6-7 sichtbar sein. Die Anzahl der Kolonien kann von Person zu Person variieren.
- Passage der Zellen am Tag 10, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben. Quantifizieren Sie die Zellen im Pellet mit einem Hämozytometer nach einer geeigneten Verdünnung in PBS. Die passageierten Zellen mit einer Dichte von 40.000 Zellen/cm2 auf eine 10 cm große Kulturplatte in einem MSC-Wachstumsmedium aussäen.
Anmerkung: Humane MSCs (Abbildung 1D) weisen eine ähnliche Morphologie wie Ratten-MSCs auf und sollten innerhalb von 2 Tagen nach der Passage eine Konfluenz von 80-90% erreichen. Sie sollten mit Hilfe der Immunzytochemie und ihrer Fähigkeit zur Trilineage-Differenzierung charakterisiert werden. Wie bei den MSCs der Ratte werden auch humane MSCs zwischen den Passagen 3 und 8 einer anschließenden hypoxischen Präkonditionierung und Anreicherung der neuralen Vorläuferzellen unterzogen.
>3. Hypoxische Vorkonditionierung
- Demontieren Sie nach dem Lösen der Ringklemme die Komponenten der Hypoxiekammer (d. h. Boden, Deckel, Tabletts) und reinigen Sie die Einzelteile mit 70 % Ethanol. Legen Sie die Kammerkomponenten zur Sterilisation 15 Minuten lang unter UV-Licht in eine Laminar-Flow-Gewebekulturhaube.
- Entfernen Sie vor der hypoxischen Präkonditionierung das Medium und spülen Sie die MSC-Kulturen der Ratte und des Menschen (Abschnitte 1 und 2) mit 10 ml PBS. Ersetzen Sie das PBS durch 10 mL MSC-Wachstumsmedium, ergänzt mit 25 mM HEPES.
Anmerkung: Die MSCs, die auf 10-cm-Schalen kultiviert wurden, sollten eine Konfluenz von 80-90 % erreicht haben, bevor sie einer hypoxischen Vorkonditionierung unterzogen wurden.
- Stellen Sie die Kulturschalen in die Hypoxiekammer. Bauen Sie die Kammerkomponenten wieder zusammen und ziehen Sie die Ringklemme fest. Ein Gasgemisch von 99 % N2/1 % O2 wird 5 min lang mit einer Durchflussmenge von 10 l/min in die Kammer gespült.
- Versiegeln Sie die Verbindungsenden der Hypoxiekammer, um sicherzustellen, dass kein Gas austritt. Stellen Sie die Kammer für 16 Stunden in den Zellinkubator (37 °C, 5 % CO2).
- Nach Abschluss der hypoxischen Vorkonditionierung entfernen Sie die Kulturen aus der Kammer, um sie für die anschließende Kultur der neuralen Vorläuferanreicherung vorzubereiten.
>4. Kultur der neuronalen Vorläufer-Anreicherung
- Bereiten Sie ein neurales Vorläufermedium vor, das aus Dulbeccos modifiziertem Adlermedium/Hams Nährstoffmischung F12 (DMEM/F12) besteht, ergänzt mit B27 (2 % v/v), basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 20 ng/ml), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF, 20 ng/ml) und P/S (1 % v/v).
- Die hypoxischen vorkonditionierten MSC für Ratte/Mensch sind wie in Schritt 1.2.2 beschrieben zu lösen. Die abgelösten Zellen werden durch Zentrifugation bei 250 x g für 5 min gesammelt. Quantifizieren Sie die Zellen im Pellet mit einem Hämozytometer nach entsprechender Verdünnung in PBS.
- Resuspendieren Sie die Zellen in neuralem Vorläufermedium und säen Sie sie auf 6-Well-Platten mit geringer Bindung bei einer Dichte von 6.000 Zellen/cm2. Stellen Sie die Kultur für 12 Tage in einen Zellinkubator (37 °C, 5 % CO2). Füllen Sie alle 3 Tage 75 % des neuralen Vorläufermediums auf.
Anmerkung: Größere nicht-adhärente Zellcluster sollten an den Tagen 6-7 beobachtet werden. Am Tag 10-12 können Neurosphären mit einem Durchmesser ≥ 100 μm beobachtet werden (Abbildung 3). Hypoxische präkonditionierte MSCs sollten mehr Neurosphären liefern als MSCs, die unter normoxischen Bedingungen kultiviert werden.
- Sammeln Sie Neurosphären an Tag 12, indem Sie sie in eine 10-ml-Pipette aspirieren und in ein konisches 15-ml-Röhrchen übertragen. Zentrifugieren Sie die Neurosphären bei 250 x g für 5 min.
Anmerkung: Neurosphären können am Tag 12 für neuronale Vorläufermarker wie Nestin und GFAP charakterisiert werden.
>5. Erzeugung von Schwann-Zell-ähnlichen Zellen
- Bereiten Sie ein gliales Induktionsmedium vor, das aus αMEM besteht, das mit β-Heregulin (100 ng/ml), bFGF (10 ng/ml), Thrombozyten-abgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF-AA, 5 ng/ml), FBS (10 %) und P/S (1 % v/v) ergänzt wird.
- Die in Abschnitt 4 hergestellten Neurosphären werden in PDL/Laminin-beschichteten 6-Well-Platten mit einer Dichte von 5-10 Kugeln pro cm,2 in 1,5 ml glialem Induktionsmedium pro Well, plattiert. Ersetzen Sie das gliale Induktionsmedium alle 2 Tage nach dem Spülen der Zellen durch PBS.
Anmerkung: Es wird beobachtet, dass Zellen aus ausgesäten Neurosphären bis zum zweiten Tag nach außen wandern. Am 7. Tag haben die wandernden Zellen ein verjüngtes Aussehen und sollten eine Immunpositivität für die Schwann-Zell-Marker p75, Neurotrophin-Rezeptor (p75) und S100β aufweisen. Diese Zellen werden als SCLCs bezeichnet.
