Erzeugung von schicksalsgebundenen Schwann-Zellen durch Kokultur mit DRG-Neuronen
>1. Präparation von gereinigten DRG-Neuronen der Ratte
- Autoklavieren Sie alle Präparierwerkzeuge (d. h. Präparierschere, Pinzette, zwei Mikrodissektionszangen und Mikrodisparierschere) mindestens 2 Stunden vor der Verwendung bei 180 °C.
- Beschichten Sie 6-Well-Gewebekulturplatten über Nacht bei 4 °C mit Poly-D-Lysin (PDL, 10 μg/mL in PBS). Entfernen Sie das PDL und spülen Sie mit 1,5 m PBS pro Vertiefung.
- Fahren Sie mit der Beschichtung der Platten mit Laminin (10 μg/ml in PBS) bei 37 °C für 2 Stunden fort. Spülen Sie die Platten mit 1,5 ml PBS pro Vertiefung.
- Bereiten Sie das DRG-Neuronenerhaltungsmedium vor, bestehend aus neurobasalem Medium, das mit B27 (2 % v/v), L-Glutamin (1 % v/v), Nervenwachstumsfaktor (NGF, 20 ng/ml) und Penicillin/Streptomycin (P/S, 1 % v/v) ergänzt wird.
- Bereiten Sie DRG-Neuronenreinigungsmedium vor, bestehend aus neurobasalem Medium, das mit B27 (2 % v/v), L-Glutamin (1 %), Nervenwachstumsfaktor (NGF, 20 ng/ml), p/s (1 %), Fluordesoxyuridin (FDU, 10 μg/ml) und Uridin (10 μg/ml) ergänzt wird.
- Trächtige Ratten am 14. bis 15. Schwangerschaftstag durch Pentobarbital-Überdosierung (240 mg/kg Körpergewicht, intraperitoneal) töten.
- Legen Sie die geopferten Tiere in Rückenlage. Reinigen Sie ihren Bauch gründlich mit 70% Ethanol.
- Schneiden Sie die untere Bauchdecke des Tieres mit einer feinen Präparierschere und einer Pinzette in Längsrichtung ein. Identifizieren und entfernen Sie die Gebärmutter mit einer Präparierschere. Schneiden Sie die Gebärmutterwand auf, um die Embryonen freizulegen und zu extrahieren. Übertragen Sie die Embryonen in eine sterile, 10 cm große Kulturschale, die mit PBS gefüllt ist. Die Kulturschale auf Eis stellen.
- Übertragen Sie den für die Dissektion bestimmten Embryo in eine sterile, 10 cm große Kulturschale, die mit PBS (Raumtemperatur) gefüllt ist, und positionieren Sie ihn unter einem Präpariermikroskop. Lassen Sie den Embryo in Bauchlage.
Anmerkung: Das weißliche Rückenmark und die daran befestigten DRGs sind über der dorsalen Seite des Embryos durch seine durchscheinende Haut zu sehen.
- Führen Sie eine Mikrodisparierzange auf beiden Seiten des Rückenmarks ein und beginnen Sie mit einer stumpfen Dissektion, das Rückenmark vom umgebenden Weichgewebe zu trennen. Schneiden Sie das Rückenmark mit einer Mikrodisparierzange entlang der Halsöffnung und des Schwanzstummels vom Tier frei. Führen Sie eine weitere stumpfe Dissektion über den ventralen Aspekt der Nabelschnur durch, um sie vom umgebenden Weichgewebe zu befreien.
- Verwenden Sie eine Mikrodisparierzange, um weiches Gewebe über der dorsalen Seite des befreiten Rückenmarks zu entfernen.
Anmerkung: In diesem Stadium sollten nur das Rückenmark, die Nervenwurzeln und das angehängte DRG übrig bleiben.
- Lösen Sie einzelne DRGs mit einer Mikrodisparierzange von ihren verbindenden Nervenwurzeln. Verwenden Sie einen Pipettenstift, der an einer 1-ml-Spitze befestigt ist, um die DRGs in ein steriles 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen zu übertragen, das PBS enthält.
Anmerkung: Für jedes 1,5-ml-Röhrchen können maximal 100 DRGs aufgenommen werden.
- Zentrifugieren Sie die DRGs bei 250 x g für 5 min und resuspendieren Sie sie in einem rekombinanten enzymatischen Zelldissoziationsreagenz (200 μl pro Röhrchen). Inkubieren (37 °C, 5 % CO2) für 10 min. Zentrifugieren Sie die DRGs 5 Minuten lang bei 250 x g, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie sie in einem DRG-Neuronenerhaltungsmedium. Dissoziieren Sie das Pellet durch sanftes Verreiben mit einer 200 μL Pipettenspitze. Quantifizieren Sie die Zellen im Pellet mit einem Hämozytometer nach einer geeigneten Verdünnung.
- Aussaat der Zellen mit einer Dichte von 5.000 Zellen/cm2 in PDL/Laminin-beschichtete 6-Well-Platten in 1,5 ml DRG-Neuronenerhaltungsmedium pro Well. Entfernen Sie nach zweitägiger Kultur das DRG-Neuronenerhaltungsmedium, spülen Sie es mit PBS und ersetzen Sie es durch das DRG-Neuronenreinigungsmedium.
Anmerkung: Behandeln Sie die DRG-Kulturen für jeden Reinigungszyklus 2 Tage lang mit Reinigungsmedium, gefolgt von 1 Tag Inkubation in Erhaltungsmedium. Nach 3-4 Reinigungszyklen ist die Entfernung aller endogenen Gliazellen zu erwarten. Dies sollte ca. 14 Tage dauern. Aufgereinigte Kulturen wurden positiv auf den neuronalen Marker TUJ1 getestet und sind für die S100β-Expression nicht vorhanden (Abbildung 1).
>2. Erzeugung von Schwann-Zell-ähnlichen Zellen
- Bereiten Sie ein gliales Induktionsmedium vor, das aus αMEM (Minimum essential medium Eagle (MEM), Alpha-Modifikationen) besteht, ergänzt mit β-Heregulin (100 ng/ml), basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 10 ng/ml), Thrombozyten-abgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF-AA, 5 ng/ml), fötalem Rinderserum (FBS, 10 %) und P/S (1 % v/v).
- Die in Abschnitt 4 vorbereiteten Neurosphären werden in PDL/Laminin-beschichteten 6-Well-Platten mit einer Dichte von 5-10 Kugeln pro cm2 in 1,5 ml glialem Induktionsmedium pro Vertiefung plattiert. Ersetzen Sie das gliale Induktionsmedium alle 2 Tage nach dem Spülen der Zellen durch PBS.
- HINWEIS: Es wird beobachtet, dass Zellen aus ausgesäten Neurosphären bis zum 2. Tag nach außen wandern. Am 7. Tag haben die wandernden Zellen ein verjüngtes Aussehen und sollten eine Immunpositivität für die Schwann-Zellmarker p75, Neurotrophin-Rezeptor (p75) und S100β7 aufweisen. Diese Zellen werden als SCLCs bezeichnet.
>3. Kokultur von SCLCs mit DRG-Neuronen
- Bereiten Sie ein Kokulturmedium vor, das aus DRG-Neuronenerhaltungsmedium (Schritt 1.1.4) und glialem Induktionsmedium (Schritt 1.2.1) in einem Volumen-zu-Volumen-Verhältnis von 1:1 besteht.
- Bereiten Sie ein Schwann-Zellerhaltungsmedium vor, das aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium/Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F12)) besteht, ergänzt mit FBS (5%), β-Heregulin (10 ng/ml) und P/S (1% v/v).
- Entfernen Sie das Kulturmedium von den SCLCs am Tag 7, spülen Sie sie mit PBS und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang mit 0,5 ml/Vertiefung rekombinantem enzymatischem Zelldissoziationsreagenz bei 37 °C. Resuspendieren Sie die SCLCs in Kokulturmedium.
- Quantifizieren Sie die Zellen mit einem Hämozytometer nach einer geeigneten Verdünnung.
- Säen Sie die SCLCs auf gereinigte DRG-Neuronenkulturen mit einer Dichte von 1.000 Zellen/cm2. Pflegen Sie die Kokulturen 14 Tage lang, wobei das Medium alle 2 Tage ausgetauscht wird.
Anmerkung: Während der Kokultur erhielten SCLCs die spindelartige Morphologie, die für reife Schwann-Zellen typisch ist (Abbildung 2). Diese Zellen bleiben nach dem Entzug der Wachstumsfaktoren in ihrem Phänotyp bestehen und sind in der Lage, Axone in vitro und in vivo zu myelinisieren. Die Positivität von Schwann-Zell-Markern (d.h. p75 und S100β) sollte durch Immunfluoreszenz überwacht werden.
- Nach Abschluss der Kokultur werden vom Schicksal begnadete Schwann-Zellen der Passage verwendet. Verwenden Sie 0,5 ml Dissoziationsreagenz pro Vertiefung. Quantifizieren Sie die Zellen mit einem Hämozytometer nach einer geeigneten Verdünnung.
