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>1. Entwicklung der Agarose-Hydrogel-Mikrosäulen
- Stellen Sie eine Agarose-Lösung mit 3 % Gewichts-/Volumenanteil (w/v) her, indem Sie 3 g Agarose wiegen und in ein steriles Becherglas mit 100 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) überführen. Geben Sie einen sterilen Magnetstab in das Becherglas und legen Sie ihn auf die Oberfläche einer Heizplatte/eines Rührers. Halten Sie das Becherglas abgedeckt, um ein Verdampfen des Inhalts im nächsten Schritt zu verhindern.
- Agarose und DPBS auf 100 °C erhitzen und bei 60-120 U/min umrühren. Passen Sie diese Einstellungen nach Bedarf an und überwachen Sie ständig den Fortschritt des Auflösungsprozesses, da die Lösung zunächst von undurchsichtig zu einem klaren Erscheinungsbild wechselt, das bedeutet, dass die Agarose vollständig aufgelöst wurde.
Vorsicht: Das heiße Becherglas und die Lösung sind heiß!
- Während die Agaroselösung erhitzt und gerührt wird, nehmen Sie vier leere 10-cm-Petrischalen und geben Sie 20 mL DPBS in zwei von ihnen. Legen Sie Akupunkturnadeln (Durchmesser: 300 μm, Länge: 40 mm), Mikroliter-Kapillarröhrchen aus Glas (Durchmesser: 701,04 μm, Länge: 65 mm, Fassungsvermögen: 25,0 μl) und einen Kolbenspender in die Biosicherheitswerkbank. Wenn die flüssige Agaroselösung ausgeschieden ist, halten Sie die Erwärmung konstant bei ca. 50 °C aufrecht und rühren Sie um, um eine Gelierung der Agarose zu vermeiden.
- Führen Sie eine Akupunkturnadel in die untere Öffnung eines Blumenzwiebelspenders ein. Führen Sie ein Kapillarrohr über die nach außen freiliegende Nadel ein. Sichern Sie das Kapillarrohr, indem Sie einen Teil davon in den Gummibereich des Kolbenspenderzylinders einführen.
- Übertragen Sie 1 ml flüssige Agarose mit einer Mikropipette auf die Oberfläche einer leeren Petrischale und bringen Sie ein Ende des Kapillarröhrchens senkrecht (mit eingeführter Nadel) in Kontakt mit Agarose, während die Gummikappe des Kolbenspenders nach innen eingeklemmt wird. Lassen Sie langsam den Druck auf den Spenderdeckel der Glühbirne ab, um Agarose in das Kapillarrohr zu ziehen.
Anmerkung: Der Transfer von flüssiger Agarose in die Kapillarröhrchen muss schnell erfolgen. Wenn die flüssige Agarose ausreichend Zeit (ca. 60 s) auf der Oberfläche der Petrischale abkühlen gelassen wird, beginnt sie zu gelieren, wodurch ein angemessenes Sogen der Agarose entlang des Kapillarrohrs verhindert wird.
- Legen Sie jede Bulb-Tube-Nadel-Einheit in eine freie Petrischale und lassen Sie das Agarosegel in den Kapillarröhrchen 5 Minuten lang erstarren. Ziehen Sie das Kapillarröhrchen vorsichtig mit den Händen aus dem Gummistopfen im Kolbenspenderzylinder und lassen Sie die Nadel und das Agarosegel im Röhrchen an Ort und Stelle.
- Ziehen Sie die Akupunkturnadel manuell heraus, indem Sie sie langsam aus dem Kapillarrohr ziehen; der neu erstarrte Agarosezylinder gleitet bei diesem Verfahren ebenfalls aus dem Rohr heraus und umgibt die Nadel weiterhin. Schieben Sie die Mikrosäule vorsichtig mit der Spitze einer sterilen Pinzette entlang der Akupunkturnadel, um sie bis zum Ende zu bewegen. Legen Sie die Nadel auf eine offene, DPBS-haltige Petrischale und schieben Sie die Mikrosäule mit einer Pinzette in das DPBS.
Anmerkung: Wenn die Agarose-Mikrosäule nach dem Entfernen der Akupunkturnadel im Glaskapillarrohr verbleibt, schieben Sie die Agarose-Mikrosäule langsam mit einer 25-mm-Nadel aus dem Kapillarrohr und in die Schale mit DPBS.
- Sterilisieren Sie Mikroskalpelle oder Pinzetten mit einem Heißperlensterilisator. Stellen Sie 4 % w/v Agarose her, indem Sie 4 g Agarose wiegen und auf 100 mL DPBS übertragen. Erhitzen und rühren Sie wie in Schritt 1.2 beschrieben, um eine klare 4%ige flüssige Agaroselösung zu erhalten. Halten Sie das Erhitzen und Rühren der Lösung während der folgenden Schritte aufrecht.
- Übertragen Sie die Petrischalen mit den Mikrosäulen in eine Präparierhaube und bewegen Sie eine Mikrosäule mit feiner Pinzette in eine leere Petrischale. Verwenden Sie das Stereoskop zur visuellen Führung und ein Mikroskalpell, um die Mikrosäulen auf die gewünschte Länge zu schneiden. Schneiden Sie beide Enden ab, um abgeschrägte Enden in einem Winkel von 45° von der Horizontalen zu bilden, um die Handhabung der Mikrosäulen während der extrazellulären Matrix (ECM) und der Zellzugabe zu erleichtern.
- Wiederholen Sie den vorherigen Schritt für drei weitere Mikrosäulen in derselben Petrischale und richten Sie die vier Konstrukte parallel mit einem Abstand von <3 mm zwischen jedem der Zylinder aus. Laden Sie 50 μl 4%ige Agaroselösung mit einer Mikropipette und gießen Sie einen Streifen/eine Linie Flüssigkeit über das Mikrosäulenarray, um die Konstrukte zu verbinden und in Vierergruppen (im Folgenden als "Mikrosäulenschiffchen" bezeichnet) zu bündeln. Vermeiden Sie die Bewegung von 4 % Agarose zu den Enden der Mikrosäulen, die das Innere verstopfen könnten, indem Sie den Abstand zwischen den Konstrukten minimieren und die Agarose schnell in einer dünnen Linie hinzufügen.
Anmerkung: Das Anordnen von Gruppen von vier Mikrosäulen zu "Booten" ist für die Herstellung der astrozytischen Gerüste nicht erforderlich. Nichtsdestotrotz dienen die Boote dazu, den Herstellungsprozess zu beschleunigen und eine sicherere Möglichkeit zu bieten, Mikrosäulen in späteren Schritten zu bewegen und zu handhaben.
- Lassen Sie das Mikrosäulenschiffchen 1-2 Minuten abkühlen, um die Gelierung der zugesetzten 4% Agarose zu ermöglichen. Nehmen Sie das Mikrosäulenschiffchen mit der feinen Pinzette an der verbindenden 4%igen Agarose auf und bringen Sie die Mikrosäulen in die andere DPBS-haltige Petrischale, die in Schritt 1.1.3 vorbereitet wurde. Stellen Sie nach Belieben weitere Boote mit den restlichen Mikrosäulen her.
- Die Petrischalen mit den Mikrosäulen und/oder den Schiffchen in eine Biosicherheitswerkbank bringen und 30 Min. lang unter Einwirkung von ultraviolettem (UV) Licht sterilisieren< >
Vorsicht: Tragen Sie einen geeigneten Schutz, um UV-Strahlung zu vermeiden.
- Lagern Sie die Schalen mit den Mikrosäulenschiffchen in DPBS bei 4 °C, wenn die ECM-Zugabe und Zellplattierung nicht unmittelbar danach erfolgt, bis zu 1 Woche. Wiederholen Sie die Fertigungsschritte für Mikrosäulen, wenn die Konstrukte während dieses Zeitraums nicht verwendet werden.
>2. Primäre Zellkultur und Isolierung
- Kortikale Astrozytenisolierung von Rattenbabys
- Zur Vorbereitung auf die folgenden Schritte geben Sie 20 ml Hank's balanced salt solution (HBSS) in vier 10 cm große Petrischale, die als Reservoire für das präparierte Gewebe dienen. Bewahren Sie alle Gerichte auf Eis auf. Sterilisieren Sie saubere chirurgische Scheren, Pinzetten, Mikrospatel und Mikroskalpelle in einem Heißperlensterilisator.
- 0,25 % Trypsin mit 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,15 mg/ml Desoxyribonuklease (DNase) I in HBSS bei 37 °C vorwärmen. Zusätzlich wird das Astrozyten-Kulturmedium auf 37 °C vorgewärmt, das aus Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit Ham's F-12 Nährstoffmischung und 10 % fötalem Rinderserum (FBS) besteht.
- Betäuben Sie die Sprague-Dawley-Rattenwelpen nach der Geburt am Tag 0 oder Tag 1, indem Sie sie unterkühlten Bedingungen aussetzen und durch Enthauptung einschläfern. Stecke den Kopf mit einer 19-mm-Nadel, die in der Schnauze vor den Augen platziert wird, in eine Stufe.
- Machen Sie einen Schnitt mit einem Skalpell in der Mitte von hinten nach vorne, von der Basis des Halses bis knapp hinter die Augen. Führen Sie einen weiteren Schnitt durch, der seitlich von direkt hinter den Augen nach unten verläuft und eine T-Form bildet. Ziehe die Schädelhaut/den Schädel mit einer feinen Pinzette zur Seite.
- Halten Sie den Kopf an der Schnauze (mit dem Gesicht nach oben), indem Sie einen Zacken der Pinzette in das Maul des Tieres und den anderen auf die Außenfläche legen. Entfernen Sie das Gehirn mit einem sterilen Mikrospatel und legen Sie es in eine der mit gekühltem HBSS gefüllten Petrischale. Stellen Sie diese Petrischale sofort danach und immer auf Eis, außer wenn sie in Gebrauch ist.
- Platzieren Sie einen Granitblock, der zuvor bei -20 °C gelagert wurde, unter einem Stereoskop in einer Sezierhaube. Legen Sie die Petrischale mit dem Hirngewebe auf die Oberfläche des Granitblocks, um die niedrige Temperatur während des Seziervorgangs zu erhalten. Verwenden Sie das Stereoskop als visuelle Anleitung in den folgenden Schritten.
- Wenn die Riechkolben intakt geblieben sind, extrahieren Sie sie durch Schneiden mit einer Pinzette oder einem Mikroskalpell. Verwenden Sie außerdem ein Mikroskalpell, um das Kleinhirn zu entfernen und einen Mittellinienschnitt zu machen, der die beiden Gehirnhälften trennt. Übertragen Sie die Hemisphären mit einer Pinzette in eine Petrischale, die frisches, gekühltes HBSS enthält.
- Präparieren Sie die Mittelhirnstrukturen von der Innenseite der Hemisphären mit einem Mikroskalpell, um nur die getrennten Kortexe zu erhalten. Mit einer feinen Pinzette die Hirnhäute, eine blattartige Struktur, vom kortikalen Gewebe ablösen und die isolierten Kortikale mit kaltem HBSS in eine neue Petrischale übertragen. Verwenden Sie das Mikroskalpell, um das Gewebe zu zerkleinern, um die Oberfläche für die Trypsinwirkung im nächsten Schritt zu vergrößern.
- Verwenden Sie eine Pasteurpipette, um die Kortikale in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen zu übertragen, das 4 mL vorgewärmtes Trypsin-EDTA enthält (8 Kortikale in jedem Röhrchen). Setzen Sie das kortikale Gewebe für 5-7 min bei 37 °C Trypsin-EDTA aus.
- Entfernen Sie mit einer Pasteurpipette vorsichtig das Trypsin-EDTA und geben Sie 400 μl 0,15 mg/ml DNAse I-Lösung in das Zentrifugenröhrchen. Bewegen Sie das Röhrchen oder den Wirbel, bis das gesamte Gewebe dissoziiert ist und sich keine Gewebereste mehr in der Flüssigkeit befinden. Wenn es nicht möglich ist, das Gewebe vollständig aufzulösen, entfernen Sie die verbleibenden Fragmente mit der Spitze einer Pasteur-Pipette.
- Das Röhrchen mit der dissoziierten Zelllösung bei 200 x g wird 3 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird mit einer Pasteurpipette entfernt, ohne die Zellen zu stören. 1 ml Astrozyten-Kulturmedium (definiert in Schritt 2.1.2) mit einer Mikropipette in das Röhrchen geben und umrühren, um zu resuspendieren und eine homogene Lösung zu erzeugen.
- 10 ml Astrozyten-Kulturmedium mit einer serologischen Pipette in einen T-75-Kolben überführen. 250 μl der 1-ml-Zelllösung (hergestellt in Schritt 2.1.11) mit einer Mikropipette in den Kolben geben, um Zellen im Wert von einem Welpengehirn pro Kolben zu pantieren. Verteilen Sie die entladene Zelllösung gleichmäßig über das Kulturmedium und rühren Sie den Kolben vorsichtig um, um eine gleichmäßige Verteilung weiter zu fördern.
- Die plattierten Kolben werden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Nach Erreichen von 24 und 72 Stunden in Kultur wird der Kolben mechanisch bewegt, um nicht adhärente Zelltypen wie Neuronen und Oligodendrozyten abzulösen.
- Führen Sie anschließend zu jedem dieser Zeitpunkte einen Medienwechsel durch. Halten Sie den Kolben senkrecht, so dass das Nährmedium auf dem Boden des Kolbens liegt und die anhaftenden Zellen nicht bedeckt. Aspirieren Sie das Nährmedium mit einer Pasteurpipette und drücken Sie die Spitze der Pipette gegen die untere Ecke des Kolbens, um eine Extraktion der Zellen zu vermeiden. Den Kolben in die ursprüngliche horizontale Position bringen und mit einer serologischen Pipette vorsichtig 10 ml Astrozytenmedium über die Zellen geben.
- Setzen Sie die Kolben nach jedem Medienwechsel wieder in den Inkubator ein. Nachdem eine Konfluenz von 90 % erreicht ist, wird der Kolben erneut mechanisch bewegt, um alle verbleibenden nicht anhaftenden Zellen zu entfernen.
- Passieren Sie die Astrozyten, indem Sie das Nährmedium mit einem Vakuum und einer Pasteurpipette herausnehmen. Geben Sie 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA mit einer serologischen Pipette über die adhärenten Zellen. Den Kolben vorsichtig umrühren, um sicherzustellen, dass das Trypsin alle Zellen bedeckt, und den Kolben 5-7 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Quenchen Sie Trypsin, indem Sie den Zellen mit einer serologischen Pipette 1 ml Astrozytenmedium zusetzen. Die Zelllösung wird mit einer serologischen Pipette aus dem Kolben extrahiert und in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 x g für 3 min.
- Entfernen Sie den Überstand mit einer serologischen Pipette und resuspendieren Sie ihn in 1 mL Astrozyten-Nährmedium. Rühren Sie das Röhrchen, um sicherzustellen, dass die Zelllösung homogen ist. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in der Lösung mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
Anmerkung: Ein Kolben, der zu 90 % konfluent ist, liefert in der Regel etwa 3 Millionen Astrozyten.
- Geben Sie 10 ml Astrozyten-Nährmedium in einen T-75-Kolben. Eine Verdünnung im Verhältnis 1:4 wird durchgeführt, indem 250 μl der Zelllösung (Schritt 2.1.18) mit einer Mikropipette in den T-75-Kolben überführt werden, der bereits Kulturmedium enthält. Vorsichtig rühren, um eine homogene Zellverteilung auf der Oberfläche des Kolbens zu gewährleisten.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1.16-2.1.19 jedes Mal, wenn eine Konfluenz von 90 % erreicht ist, um die Zellen zu passieren.
- Kortikale Neuronenisolierung aus Rattenföten
- Befolgen Sie ähnliche Vorbereitungen wie in den Schritten 2.1.1 und 2.1.2, mit der Ausnahme, dass es sich bei dem vorgewärmten Medium um Co-Kulturmedien handelt, bestehend aus Neurobasalmedium + 2 % B-27-Supplement (für Neuronen) + 1 % G-5 serumfreies Supplement (für Astrozyten) + 0,25 % L-Glutamin.
- Einschläferung von zeitlich schwangeren embryonalen Sprague-Dawley-Ratten Tag 18 mit Kohlendioxid-Erstickung und Bestätigung des Todes durch Enthauptung.
- Extrahieren Sie die Rattenföten und präparieren Sie die Kortexe vom Rest des Hirngewebes in Petrischale, die HBSS auf der Oberfläche des gekühlten Granitblocks enthalten, mit einem Stereoskop zur visuellen Führung und einer sterilisierten Schere, einem Mikroskalpell und einer Pinzette. Nach der sukzessiven Dissektion des Kopfes, des Gehirns, der Gehirnhälften und der Hirnrinde wird jedes Gewebe in eine neue, mit HBSS gefüllte Petrischale übertragen.
- Zerkleinern Sie das kortikale Gewebe in kleinere Fragmente, um die Oberfläche für Trypsin zu vergrößern. Übertragen Sie 4-6 Kortikale mit einer Pasteur-Pipette in ein Röhrchen mit 5 mL vorgewärmtem Trypsin-EDTA und halten Sie es bei 37 °C, um das Gewebe zu dissoziieren. Rühren Sie das Röhrchen nach 5-7 Minuten manuell um, um das Gewebe zu mischen und ein Verklumpen des Gewebes zu verhindern.
- Entfernen Sie den Schlauch bei 37 °C nach 10 min. Wie bereits in Schritt 2.1 erläutert, extrahieren Sie das Trypsin-EDTA und ersetzen Sie es durch 1,8 ml 0,15 mg/ml DNAse-Lösung. Anschließend wird das Gewebe so lange gewirbelt, bis die Lösung homogen erscheint und keine Gewebefragmente mehr in der Flüssigkeit schwimmen.
- Die dissoziierte Gewebelösung bei 200 x g für 3 min zentrifugieren. Nach Entfernen des Überstands in 2 ml Co-Kulturmedium resuspendieren. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in dieser Lösung mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
Anmerkung: Die übliche Ausbeute beträgt 3,0-5,0 x 106 Zellen/kortikale Hemisphäre.
- Bereiten Sie eine neue Zelllösung mit einer Dichte von 2,0-4,0 x 105 Zellen/ml in dem oben definierten Co-Kulturmedium vor.
>3. Entwicklung der Astrozytenkabel in den Mikrosäulen
- Herstellung von ECM-Kernen
HINWEIS: Die EZM muss am selben Tag, an dem die Zellaussaat durchgeführt wird, in das Innere der Hydrogel-Mikrosäulen gegeben werden.
- Bereiten Sie in einer Biosicherheitswerkbank eine 1 mg/ml-Lösung von Rattenschwanz-Typ-I-Kollagen in Co-Kulturmedium in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen vor. Halten Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit der ECM-Lösung immer auf Eis, außer wenn es verwendet wird.
- Übertragen Sie 1-2 μl der EZM-Lösung mit einer Mikropipette auf einen Streifen Lackmuspapier, um den pH-Wert zu schätzen. 1 μl 1 N Natriumhydroxid (NaOH) oder Salzsäure (HCl) mit einer Mikropipette hinzufügen, um den pH-Wert der EZM-Lösung zu erhöhen bzw. zu senken, und zum Homogenisieren nach oben und unten pipettieren. Überprüfen Sie den neuen pH-Wert mit einem Lackmuspapierstreifen und fügen Sie je nach Bedarf mehr Säure oder Base hinzu, bis der pH-Wert stabil im Bereich von 7,2 bis 7,4 liegt.
- Bewegen Sie die Petrischalen von Schritt 1.2 in eine Präparierhaube und überführen Sie 4-5 Mikrosäulen oder ein Schiffchen mit steriler Feinzange in eine leere, sterile 35 oder 60 mm Petrischale. Positionieren Sie die 10-μl-Spitze einer Mikropipette mit dem Stereoskop an einem Ende jeder Mikrosäule und saugen Sie sie ab, um das Lumen von DPBS und Luftblasen zu entleeren. Bestätigen Sie mit dem Stereoskop, dass keine Luftblasen vorhanden sind, um sicherzustellen, dass das im nächsten Schritt hinzugefügte ECM frei über das Lumen fließen kann.
- Füllen Sie eine P10-Mikropipette mit ECM-Lösung, platzieren Sie die 10-μl-Spitze an einem Ende der Hydrogel-Mikrosäulen und geben Sie genügend Lösung ab, um das Lumen (ca. 3-5 μl) zu füllen, wobei Sie den Eintritt von ECM mit dem Stereoskop beobachten. Pipettieren Sie ein kleines Reservoir (2-4 μl) ECM-Lösung an beiden Enden der Mikrosäule.
Anmerkung: Bewältigen Sie immer 4-5 Mikrosäulen oder jeweils ein Boot, um ein längeres Austrocknen der Konstrukte zu vermeiden, da dies zum Zerknittern der Mikrosäulenstruktur führen kann. Vollständig getrocknete Mikrosäulen haften fest an der Oberfläche der Petrischale, was eine Verwendung für die Zellaussaat verhindert. Übermäßige Mengen an Co-Kulturmedien (als Hydratationsmaßnahme) können den Mikrosäulen nicht zugesetzt werden, da dies dazu führen kann, dass die EZM während der unten beschriebenen Inkubationszeit herausfließt.
- Pipettieren Sie das Co-Kulturmedium in einem Ring um die Petrischale, um eine Feuchtigkeitssenke zu schaffen, die ein Austrocknen der Säulen während der Inkubation verhindert. Die Petrischale, die die ECM-haltigen Mikrosäulen enthält, wird 1 h lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, um die Polymerisation des Kollagens zu fördern, bevor die Neuronen und/oder Astrozyten hinzugefügt werden.
Anmerkung: Das ECM sollte eine Schicht bilden, die die Innenfläche des Hohllumens bedeckt, anstatt einen festen ECM-Kern zu bilden, der das Innere umgibt, was beides mit dem Stereoskop beobachtet werden kann. Wenn das ECM einen Kern bildet, setzen Sie die Inkubationszeit fort, bis nur noch die Schicht übrig ist. Wenn diese Schicht gebildet ist, kann die Astrozytenzelllösung das Innere der Mikrosäule in den Beschichtungsschritten füllen.
- Bereiten Sie während der Inkubationszeit die Astrozytenzelllösung vor (wie unten beschrieben).
- Astrozyten- und Neuronenaussaat in den Mikrosäulen
- Durchgang der plattierten Astrozyten (zwischen dem vierten und zwölften Durchgang), wie in den Schritten 2.1.16-2.1.19 beschrieben. Nach Zählung der Anzahl der Zellen im Kolben wird die Zelllösung mit einer Dichte von 9,0 bis 12,0 x 105 Zellen/ml in Zellkulturmedien suspendierte Lösung hergestellt.
- Platzieren Sie mit einem Stereoskop die Spitze einer P10-Mikropipette an einem Ende der Mikrosäulen und überführen Sie ausreichend Zelllösung (~5 μl) in das Lumen, um es vollständig zu füllen. Wie oben mit der EZM gemacht, fügen Sie kleine Reservoire mit Zelllösung an beide Enden jeder Mikrosäule hinzu.
- Die plattierten Mikrosäulen auf den Petrischalen werden 1 h lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, um die Bindung der Astrozyten an die EZM zu fördern. Wenn Neuronen nicht zu Mikrosäulen hinzugefügt werden, fahren Sie mit Schritt 3.2.5 fort.
- Nach der anfänglichen Inkubationszeit werden 1-2 μl der in Schritt 2.2.7 erhaltenen kortikalen Neuronenlösung mit einer Mikropipette in beide Enden der Mikrosäulen gegeben, während unter dem Stereoskop beobachtet wird. Stellen Sie sicher, dass genügend Medien in den Schalen vorhanden sind, um ein Austrocknen zu vermeiden, und inkubieren Sie erneut 40 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2, um die Adhäsion der Neuronen zu ermöglichen.
Anmerkung: Kortikale Neuronenlösung kann auch 1-2 Tage nach der Bündelbildung hinzugefügt werden, wobei Schritt 3.2.4 durchgeführt wird, nachdem das Nährmedium vorsichtig mit einer Mikropipette aus der Petrischale entfernt wurde.
- Füllen Sie nach der Inkubationszeit die Petrischalen mit den plattierten Mikrosäulen vorsichtig mit 3 oder 6 ml Co-Kulturmedium für 35- bzw. 60-mm-Petrischale. Halten Sie die plattierten Mikrosäulen in Kultur bei 37 °C und 5 % CO2, um die Selbstorganisation der ausgerichteten astrozytären Bündel zu fördern, die nach 6-10 h eine gebündelte, kabelartige Struktur bilden sollten.