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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung des Seidengerüsts
- Herstellung der Seidenlösung aus Bombyx mori Kokons
- Schneide jeden Kokon mit einer Schere in 8 gleich große Stücke. Verwenden Sie etwa 11 Kokons für 5 g fragmentierte Kokons. (15 Minuten)
- 2 l 0,02 M Na2CO3 -Lösung zubereiten und auf einer heißen Platte zum Kochen bringen. (15 Minuten)
- Wiegen Sie 5 g zerkleinerte Kokons und kochen Sie sie in Na2CO3 -Lösung für 30 Minuten. Rühren Sie die kochende Seide alle paar Minuten mit einem Spatel um. Dieser Schritt, der als Entschleimung bezeichnet wird, reinigt Seidenfibroin von hydrophilen Proteinen, Sericinen. (30 Minuten)
- Wringen Sie das Fibroin von Hand aus und spülen Sie es mindestens dreimal in destilliertem Wasser ab, um das restliche Sericin und die Chemikalien auszuwaschen. (5 Minuten)
- Legen Sie das feuchte Fibroin auf eine Petrischale und trocknen Sie den Fibroinextrakt in der Durchflusshaube O/N.
- Wiegen Sie am nächsten Tag die trockene Fibroinmasse und geben Sie das Fibroin in ein Becherglas. (15 Minuten)
- Um das Fibroin in 9,3 M LiBr-Lösung aufzulösen, berechnen Sie das erforderliche Volumen (in ml) von LiBr, indem Sie die Masse des trockenen Fibroins mit 4 multiplizieren. Gießen Sie langsam LiBr-Lösung über das Seidenfibroin und tauchen Sie mit einem Spatel alle Fibroinfasern ein. Decken Sie das Becherglas ab, um eine Verdunstung zu verhindern, und stellen Sie es 4 Stunden lang auf 60 °C, damit sich die Fasern auflösen können. (15 Minuten)
- Sammeln Sie mit der Spritze die Fibroinlösung aus dem Becherglas und laden Sie sie in die Dialysekassetten MWCO 3.500. Führen Sie eine Dialyse mit destilliertem Wasser für 48 Stunden durch. Wechsle das Wasser alle paar Stunden.
- Mit der Spritze die Fibroinlösung aus den Kassetten in konische 50-ml-Röhrchen auffangen und zweimal bei 9.000 U/min (~12.700 x g) bei 4 °C für 20 min zentrifugieren. Gießen Sie nach jedem Zentrifugationsschritt den Überstand in ein frisches Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet. (40 Minuten)
- Messen Sie die Konzentration des Fibroins, indem Sie das Trockengewicht schätzen. Gießen Sie 1 ml Seidenlösung in eine Waage. Die Probe wird 2 Std. lang bei 60 °C im Ofen getrocknet. Wiegen Sie das trockene Seidenfibroin und berechnen Sie die Konzentration der Seidenfibroinlösung, indem Sie das erhaltene Gewicht mit 100 multiplizieren. Die erwartete Konzentration der Seidenlösung beträgt 6-9% (w/v).
- Stellen Sie die Seidenkonzentration auf 6 % (w/v) ein, indem Sie sie in destilliertem Wasser verdünnen.
Haltepunkt: Das flüssige Seidenfibroin kann in einem geschlossenen Behälter bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.
- Herstellung von porösen Gerüsten aus Seidenlösung.
- Sieben Sie das körnige NaCl, um das 500-600 μm große Granulat zu trennen, das in späteren Schritten verwendet wird. Entsorgen Sie die Granulate mit einer Größe von weniger als 500 μm und über 600 μm. (15 min)
- Gießen Sie 30 ml 6%ige Seidenlösung in die Form aus Polytetrafluorethylen (PTFE) (Abbildung 1). 60 g gesiebtes NaCl vorsichtig über die Seide streuen. Tippen Sie auf den Behälter, um eine gleichmäßige Salzschicht zu erhalten. 48 Stunden bei RT inkubieren, um die Seide zu polymerisieren.
- Stellen Sie die gerüsthaltige PTFE-Form für 1 Stunde bei 60 °C in den Ofen, um die Polymerisation abzuschließen und die restliche Flüssigkeit zu verdampfen.
- Geben Sie den Inhalt der PTFE-Form für 48 Stunden in ein Becherglas mit 2 l destilliertem Wasser, um das Salz auszulaugen. Wechseln Sie das Wasser 2-3 Mal pro Tag. Entfernen Sie die Schwammgerüste aus den Formen, wenn das Salz vollständig ausgelaugt ist.
Haltepunkt: Die Schwämme können in 4 °C warmes Wasser getaucht in einem geschlossenen Behälter gelagert werden, um ein Austrocknen der Gerüste zu verhindern.
- Schneiden Sie die Gerüste mit einem Biopsiestanzer mit einem Durchmesser von 5 mm aus, wenn sie fertig sind. Schneiden Sie die Gerüste so vor, dass sie eine Höhe von ca. 2 mm erreichen. Stanzen Sie die Mitte des Gerüsts mit dem Biopsiestempel mit einem Durchmesser von 2 mm aus (Abbildung 2A). (1 Std.)
- Autoklavieren Sie die Gerüste in Wasser, um sie zu sterilisieren (Nasszyklus, 121 °C, 20 min).
Haltepunkt: Die Schwämme können in 4 °C warmes Wasser getaucht in einem geschlossenen Behälter gelagert werden, um ein Austrocknen der Gerüste zu verhindern.
- Tauchen Sie die Gerüste vor der geplanten Zellaussaat in eine sterile 0,1 mg/ml Poly-D-Lysin (PDL)-Lösung. 1 Stunde bei 37 °C inkubieren.
- Waschen Sie die Gerüste 3x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um ungebundenes PDL zu entfernen. (30 Minuten)
>2. Isolierung von kortikalen Neuronen der Ratte
- Präparieren Sie Kortikale von embryonalen Tag-18-Ratten (E18) Sprague-Dawley, nachdem das genehmigte Tierprotokoll erstellt wurde. (2 Std.)
- 10 Kortiken in 5 ml 0,25 % Trypsin mit 0,3 % DNase I (aus der Bauchspeicheldrüse) für 20 min bei 37 °C inkubieren.
- Inaktivieren Sie das Trypsin durch Zugabe von 1 mg/ml Sojaprotein.
- Zerreiben Sie die Kortikale mit einer 10-ml-Pasteurpipette, indem Sie 20 Mal auf und ab pipettieren, bis eine Einzelzellsuspension erzeugt wird. Seien Sie sanft und vermeiden Sie Luftblasenbildung. (10 Minuten)
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 127 x g für 5 min.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml Kulturmedium (Neurobasalmedium, 1x B27-Supplement, 1x Glutamax, 1% Penicillin/Streptomycin). Zählen Sie die Zellen. Die erwartete Zellkonzentration liegt bei ca. 2x107/ml. (20 min)
>3. Aufbau von Versammlung und Kultur
- Gerüstaussaat mit Zellen
- Transportieren Sie die sterilen Gerüste und alle erforderlichen Utensilien in eine Zellkulturhaube. Platzieren Sie die Gerüste mit einer sterilen Pinzette in einer 96-Well-Zellkulturplatte und ordnen Sie ein Gerüst pro Vertiefung zu. (10 Minuten)
- Tauchen Sie die Gerüste in das Zellkulturmedium, um sie vor der Zellaussaat auszugleichen. 1 Stunde bei 37 °C inkubieren. (10 min)
- Saugen Sie den Überschuss des Mediums aus den Gerüsten an.
- 100 μl Zellsuspension/Gerüst auftragen. (10 Minuten)
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C O/N, um die Zellanhaftung am Gerüst zu ermöglichen.
- Am nächsten Morgen werden die nicht anhaftenden Zellen aspiriert und 200 μl/Vertiefung frisches Kulturmedium aufgetragen. (10 Minuten)
- Gerüsteinbettung mit Kollagenmatrix. (2 Std.)
- 10x PBS, Wasser, 1 N NaOH und Rattenschwanz I Kollagen auf Eis legen. Bereiten Sie eine Arbeitslösung aus Kollagen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Auf Eis halten, bis die zellbesiedelten Konstrukte bereit sind (bis zu 1 Stunde).
- Nehmen Sie die zellbesäten Seidenkonstrukte aus dem Inkubator und saugen Sie das überschüssige Medium ab.
- Übertragen Sie die Gerüste mit einer sterilen Pinzette in die leeren Vertiefungen auf der Vertiefungsplatte und tauchen Sie jedes Gerüst in 100 μl 3 mg/ml Kollagenlösung. Stellen Sie die Gewebekulturplatte für 30 Minuten wieder in den Inkubator, um die Kollagenpolymerisation zu ermöglichen.
- 100 μl vorgewärmtes Zellkulturmedium/-well auftragen. Kultivieren Sie die Konstrukte eine Woche lang und wechseln Sie das Medium jeden Tag, indem Sie nur die Hälfte des Volumens des Mediums ersetzen.
