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>1. Differenzierungszeitraum vor der Neubeschichtung
- Differenzieren Sie Neuronen auf 10-cm-Schalen mit einem Protokoll Ihrer Wahl, bis die Neuronen mit ihren Prozessen ein dickes Netzwerk gebildet haben und nicht nur frühe neuronale Marker wie MAP2 oder TuJ1, sondern auch späte Marker wie NeuN exprimieren.
- Wechseln Sie während des neuronalen Differenzierungsprozesses alle 4 Tage die Hälfte des Mediums Ihrer Wahl.
Anmerkung: Umfangreichere oder häufigere Wechsel des Mediums verwässern essentielle trophische Faktoren aq und könnten die Reifung begünstigen.
- Verwenden Sie für die iPSC-abgeleiteten WT126-Neuronen die folgenden Kultivierungsmedien nach der Differenzierung: 5 ml 100x N2 (neurale) Ergänzung, 10 ng/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF), 10 ng/mL glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF), 1 μg/mL Laminin, 200 μM Ascorbinsäure, 1 μM Dibutyryl-cAMP und 10 mL SM1 für 500 mL Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium/Nährstoff-Gemisch F-12 (DMEM/F12). Ersetzen Sie nach und nach mit halben Medienwechseln durch neuronales Basalmedium (Materialtabelle) und die gleichen Ergänzungen.
- Verwenden Sie für die induzierten pluripotenten Stammzellen oder iPSC-abgeleiteten CVB-WT-Neuronen das folgende Kultivierungsmedium nach der Differenzierung: 500 ml neurales Basal-A-Medium (Materialtabelle) und 500 ml DMEM/F12-Medium mit 2 μg/mL Laminin, 10 mL Glutamin-Supplement (Materialtabelle), 0,75 mg/ml Natriumbicarbonat, 5 ml Minimum essentielles Medium (MEM) nichtessentielle Aminosäuren, 0,2 mM Ascorbinsäure, 10 ng/ml BDNF, 20 mL 50x B27 und 10 mL 100x N2 Ergänzung.
>2. Beschichtung von Multiwells
- Am Tag vor dem Überziehen mit Poly-L-Ornithin (PLO) beschichten. PLO in sterilem Wasser auflösen, um eine Stammlösung (10 mg/ml) herzustellen. Lagern Sie diesen Fond bei -20 °C. Verdünnen Sie PLO 1:100 in Wasser, um eine Konzentration von 50 μg/mL bei der Beschichtung von Glas und ein Verhältnis von 1:1.000 (10 μg/ml) bei der Beschichtung von Kunststoff zu erhalten.
- Tragen Sie die Beschichtung direkt auf die Zielplatten auf. Verwenden Sie das für die Plattengröße geeignete Beschichtungsvolumen (d. h. für eine 24-Well-Platte tragen Sie 500 μl PLO-Lösung pro Well auf).
- Lassen Sie die Teller über Nacht bei Zimmertemperatur im Dunkeln stehen.
- Entnahme der beschichteten Platten am Tag der Beschichtung und Überführung in eine sterile Biosicherheitswerkbank.
- Aspirieren Sie die PLO-Lösung und spülen Sie sie zweimal mit sterilem Wasser ab.
- Verdünnen Sie Laminin (1,15 mg/ml) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei einer Verdünnung von 1:400.
Anmerkung: Tauen Sie Laminin bei 4 °C auf und geben Sie es schnell zu PBS, um eine Ansammlung von Laminin und eine ungleichmäßige Beschichtung zu vermeiden.
- Steriles Wasser aspirieren und 500 μl Lamininbeschichtung auf die zuvor mit PLO beschichteten Vertiefungen auftragen.
- Stellen Sie die Platten für mindestens 4-6 Stunden in einen 37 °C Inkubator. Verwenden Sie längere Inkubationszeiten von bis zu 16 Stunden für Glasflächen. Verwenden Sie konsistente Inkubationszeiten.
>3. Differenzierte Neuronen neu plattieren
- Spülen Sie die Platte mit differenzierten Neuronen einmal vorsichtig mit PBS aus. Dispergieren Sie PBS sanft an der Wand der Platte und nicht direkt auf den Zellen, um eine Störung der Zellen zu vermeiden.
- Aspirieren Sie PBS vorsichtig und achten Sie darauf, die Zellen nicht direkt zu berühren, sondern vom Rand der Schale aus zu aspirieren, während Sie sie in Richtung des Forschers kippen.
- Tragen Sie mindestens 1 ml des proteolytischen Enzyms (Table of Materials) pro 10 cm Platte auf und geben Sie die Zellen wieder in den Inkubator. Fügen Sie etwas höhere Volumina hinzu, wenn der Gewebekulturraum aufgrund der niedrigen Luftfeuchtigkeit eine hohe Verdunstungsrate aufweist.
- Inkubieren Sie Zellen mit proteolytischem Enzym für 40-45 Minuten, um sie von der Platte zu lösen und von anderen Neuronen innerhalb des neuronalen Netzwerks zu lösen.
Anmerkung: Das Timing in diesem Schritt ist entscheidend. Ein zu frühes Löschen der Protease kann nach der Replatination zu einem erhöhten Zelltod führen. Der Hersteller proteolytischer Enzyme empfiehlt, Temperaturen weit unter 37 °C mit längeren Inkubationszeiten für die Passage von Zelllinien (z. B. über Nacht bei 4 °C) zu verwenden. Der Umgang mit Neuronen bei 4 °C sollte jedoch vermieden werden, da sie nach Kälteexposition oft ein schlechtes Überleben zeigen. Der Hersteller gibt außerdem an, dass eine 60-minütige Inkubation mit dem Enzym bei 37 °C zu seiner enzymatischen Inaktivierung führt. Nach den Erfahrungen der Autoren ist jedoch eine 40-45-minütige Inkubation von hiPSC-abgeleiteten neuronalen Kulturen bei 37 °C ausreichend für eine effiziente Dissoziation und ein hervorragendes neuronales Überleben nach der Replatingierung.
- Überprüfen Sie die Neuronen während der Inkubationszeit an einem Phasenkontrastmikroskop und lassen Sie die Proteasebehandlung so lange weitergehen, bis sich das neuronale Netzwerk vollständig von der Platte löst und nach kurzem Schütteln der Platte unter dem Mikroskop in kleinere Blätter zerfällt.
- Queten Sie die Proteaseaktivität mit 5 mL frischem DMEM-Medium pro 1 mL Protease in der 10-cm-Platte, um den Aufschluss zu stoppen. Zerreiben Sie die Zellen vorsichtig 5-8 Mal gegen die Platte, um das Netzwerk mit serologischen Pipetten zu unterbrechen. Achten Sie darauf, beim Trituieren nicht zu viel Druck auszuüben, da differenzierte Neuronen zerbrechlich sind. Verwenden Sie keine P1000-Spitze, da das Ende zu scharf und schmal ist und somit die Neuronen durchsichtig oder beschädigt werden kann.
- Tragen Sie die Lösung mit den Zellen durch ein Zellsieb mit einem Netz mit einem Durchmesser von 100 μm tropfenweise in ein frisches konisches 50-ml-Röhrchen auf.
- Spülen Sie das Sieb mit weiteren 5 ml frischem DMEM-Medium aus, nachdem die Zellen durchfiltriert sind.
- Zellen in einer Tischzentrifuge bei 1.000 x g für 5 min drehen.
- Bringen Sie das konische Röhrchen wieder in die Biosicherheitswerkbank und saugen Sie den größten Teil des Mediums ab, wobei etwa 250 μl übrig bleiben, um sicherzustellen, dass die Zellen die Feuchtigkeit speichern.
- Resuspendieren Sie die Zellen schonend in 2 mL frischem DMEM-Medium. Pipettieren Sie das Pellet nicht gegen die Seite des Röhrchens. Drehen Sie stattdessen das konische Röhrchen vorsichtig 2-3 Mal um und führen Sie die Zellen durch das Ende einer serologischen 5-ml-Pipette, um sie zu lösen.
- Tragen Sie 10 μl resuspendierte Neuronen auf den Rand eines Hämozytometers auf.
- Geben Sie 8-10 μl Trypanblau in den Zelltröpfchen, um die Lebensfähigkeit der Zellen während dieses Resuspensionsschritts zu beurteilen. Tragen Sie 10 μl dieser Mischung auf das Hämozytometer oder andere automatische Zellzähler auf. Beurteilen Sie diejenigen Zellen als lebensfähig, die phasenhell sind und den Farbstoff Trypanblau ausschließen.
- Bestimmen Sie die Menge an lebensfähigen Zellen/ml und bereiten Sie die Verdünnung des Inhalts des konischen Röhrchens entsprechend der gewünschten Zelldichte vor.
- Platte ~10.000 Zellen pro Well für eine 384-Well-Platte; Platte ~150.000-200.000 Zellen pro Well für eine 24-Well-Platte.
- Geben Sie frisches DMEM in das konische Röhrchen der resuspendierten Zellen, um eine angemessene Verdünnung zu erreichen, und fügen Sie je nach den Anforderungen der spezifischen Zelllinie zusätzliche geeignete Ergänzungen wie B27 und/oder BDNF hinzu.
- Kippen Sie das konische Rohr vorsichtig, um es 2-3 Mal zu mischen.
- Die Lamininbeschichtung mit einer 16-Kanal-Pipette von der 24-Well-Platte oder von der 384-Well-Multiwell-Platte absaugen und einmal mit PBS spülen.
- Aspirieren Sie PBS mit einer P1000 für die 24-Well-Platte oder der 16-Kanal-Pipette für 384-Well-Platten.
- Tragen Sie die Zelllösung in einer Achterbewegung auf jede Vertiefung auf, um ein Verklumpen zu vermeiden. Die Gleichmäßigkeit der Beschichtung kann auch durch den Einsatz automatisierter Liquid-Handling-Geräte optimiert werden.
Anmerkung: Die Zugabe von Laminin zum Medium ab 2-4 Tagen nach der Beschichtung trägt ebenfalls zur Aufrechterhaltung einer homogenen Verteilung der Zellen bei.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.19 und 3.20 für jede Vertiefung.
- Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator, der auf 37 °C und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist.
- Beginnen Sie nach 2 Tagen mit dem Wechsel der Hälfte des Mediums alle 4 Tage mit dem in Abschnitt 1.2 beschriebenen Kultivierungsmedium nach der Differenzierung.