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>1. Herstellung von SU-8-Formen durch Fotolithographie
HINWEIS: Bei diesem Verfahren kommen gefährliche Chemikalien zum Einsatz. Verwenden Sie durchgehend Abzüge und PSA.
- Reinigen Sie den Siliziumwafer (4 Zoll Durchmesser, 1 mm Dicke, poliert) mit Aceton und blasen Sie ihn mit Stickstoffgas an. Dann bei 180 °C 3 min trocknen lassen.
- Geben Sie 3 mL SU-8 2100 auf einen gereinigten Wafer.
- Das SU-8 wird mit einem Spin Coater bei 500 U/min für 10 s gleichmäßig auf dem Wafer beschichtet und dann nacheinander 30 s lang bei 1500 U/min mit einer Beschleunigung von 300 U/min gedreht, um eine 150 μm dicke Schicht aus SU-8.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Siliziumwafer in der Mitte des Spin Coaters positioniert und korrekt durch Vakuum fixiert ist.
- Die Waffel auf der Herdplatte bei 50 °C für 10 min, bei 65 °C für 7 min und bei 95 °C für 45 min weich backen.
- Stellen Sie die Fotomaske (Abbildung 1) auf den Masken-Aligner ein und belichten Sie das UV-Licht (365 nm) für 60 s.
HINWEIS: Die Belichtungszeit muss durch eine angemessene Dosis UV-Licht optimiert werden.
- Nach der Belichtung den Wafer bei 65 °C für 6 min und bei 95 °C für 13 min auf der heißen Platte backen.
- Entwickeln Sie den Wafer für 10-20 Minuten im SU-8-Entwickler unter Rühren mit einem Orbitalschüttler und wechseln Sie die Entwicklungslösung einmal während des Prozesses.
HINWEIS: Verlängern Sie die Entwicklungszeit, wenn die Rückstände von SU-8 zurückbleiben.
- Spülen Sie den Wafer in Isopropanol ab und trocknen Sie den Wafer vorsichtig mit Stickstoffgas ab.
- Messen Sie die Höhe des abgeschiedenen SU-8 mit einem Messmikroskop und stellen Sie sicher, dass es ca. 150 μm dick ist. Es kann unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden.
2. Herstellung von mikrofluidischen Gewebekulturchips aus Polydimethylsiloxan (PDMS)
- Befestigen Sie den SU-8-abgeschiedenen Wafer mit doppelseitigem Klebeband an einem Behälter (z.B. 15 cm Petrischale aus Kunststoff).
- Blasen Sie den Staub mit Stickstoffgas vom Wafer.
- Zur Silanisierung legen Sie den SU-8-abgeschiedenen Wafer zusammen mit einem kleinen Behälter (z.B. 35 mm Schale) in eine Vakuumkammer. Geben Sie 10 μl (Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorsilan in den kleinen Behälter. Tragen Sie das (Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorsilan nicht direkt auf den SU-8-Wafer auf.
- Verschließen Sie die Vakuumkammer fest und schalten Sie eine Vakuumpumpe für mindestens 2 h ein.
- Nehmen Sie einen Plastikbecher und gießen Sie das Silikonelastomer (z. B. Silpot 184 oder gleichwertig, Sylgard 184) und das Härter in einem Gewichtsverhältnis von 10:1 ein. Dann mit einem Spatel gut mischen und in der Vakuumkammer entgasen, bis die Blasen vollständig entfernt sind.
- Gießen Sie die PDMS-Mischung in den Behälter mit dem SU-8-Wafer auf die gewünschte Dicke (3-4 mm) und entgasen Sie erneut, um Blasen zu entfernen.
- Das PDMS im Ofen bei 60 °C mindestens 3 Stunden backen, damit es vollständig aushärtet.
- Schneiden Sie nach dem Abkühlen das ausgehärtete PDMS mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge vom Wafer ab.
- Um die beiden Kammern des Gewebekulturchips herzustellen, stanzen Sie mit einem Biopsiestanzer mit einem Durchmesser von 1,5 mm zwei Löcher an den Stellen, an denen sich die beiden Kompartimente befinden.
- Um ein mittleres Reservoir zu schaffen, bereiten Sie eine weitere PDMS-Mischung (Silikonelastomer und das Härter im Gewichtsverhältnis 10:1) vor und gießen Sie sie in eine neue 10 cm Petrischale. Stellen Sie das Gießvolumen auf 5 mm Dicke des PDMS ein.
- Das PDMS im Ofen bei 60 °C mindestens 3 Stunden backen, damit es vollständig aushärtet.
- Schneiden Sie nach dem Abkühlen des PDMS das ausgehärtete PDMS mit einem Skalpell ab, um einen rechteckigen Ring zu erhalten.
- Verbinden Sie die untere Schicht mit dem Mediumreservoir, indem Sie ungehärtetes PDMS zwischen sie auftragen und die zusammengesetzten PDMS-Schichten einbrennen. Diese gebundene Struktur führt zum PDMS-Gewebekulturchip.
- Reinigen Sie den PDMS-Gewebekulturchip mit Klebeband, um Staub und kleine Partikel von der Oberfläche zu entfernen. PDMS-Gewebekulturchips können bei Raumtemperatur gelagert werden, wenn sie vor Staub und UV-Strahlung geschützt sind.
>3. Vorbereitung der Kultur
- Kulturmedium
Anmerkung: Alle unten aufgeführten Medien sollten, sofern nicht anders angegeben, für die Sterilisation gefiltert werden. Vorbereitete Medien können bei 4 °C gelagert und innerhalb eines Monats verwendet werden.
- Zur Zubereitung von mTeSR Plus medium: Kombinieren Sie eine Flasche 100 mL mTeSR Plus 5x Supplement mit einer Flasche 400 mL mTeSR Plus Basal Medium.
- Zur Herstellung von 100 ml KSR-Medium: In 85 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium oder DMEM/F12 fügen Sie 15 ml Knockout-Serumersatz (KSR, 15%), 1 ml kommerzielles Glutaminpräparat (1%) und 1 ml nicht-essentielle Aminosäure (NEAA, 1%) hinzu.
- Zur Herstellung von 100 ml N2-Medium: In 100 ml neurobasales Medium fügen Sie 1 ml N2 (100x), 1 ml kommerzielles Glutaminpräparat und 1 ml NEAA hinzu.
- Zur Herstellung von 250 ml Reifungsmedium: In 250 ml neurobasales Medium fügen Sie 5 ml B27 (2%), 2,5 ml kommerzielles Glutaminpräparat (1%) und 2,5 ml Penicillin/Streptomycin (1%) hinzu.
- Resuspendieren Sie die Verbindungen (Retinsäure (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) in DMSO in Zellkulturqualität auf die gewünschte Konzentration. Bereiten Sie Aliquote vor und lagern Sie sie bei -20 °C bis zu 6 Monate. Folgende Stammlösungen werden verwendet: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- Beschichtung
Anmerkung: Um eine Polymerisation der Basalmembranmatrix durch Hitze zu verhindern, vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen. Führen Sie alle Beschichtungsvorgänge nach Möglichkeit mit vorgekühlten Pipettenspitzen und -röhrchen durch. Die Basalmembranmatrix sollte über Nacht bei 4 °C aufgetaut und mit vorgekühlten Pipettenspitzen und -röhrchen aliquotiert werden. Die Aliquoten können bei -20 °C oder -80 °C eingefroren werden.
- Tauen Sie das gefrorene Aliquot bei 4 °C auf Eis auf. Das Aliquot sollte während des Beschichtungsvorgangs kalt gehalten werden. Verdünnen Sie die Basalmembranmatrix mit einer vorgekühlten Pipettenspitze mit eiskaltem DMEM/F12 im Verhältnis 1:40. Unbenutzte verdünnte Basalmembranmatrix kann 2-3 Tage bei 4 °C gelagert werden, sofern keine Polymerisation stattgefunden hat.
- Fügen Sie 1 ml der Basalmembranmatrix/DMEM-F12-Lösung hinzu, um eine Vertiefung der 6-Well-Platte zu beschichten.
- Inkubieren Sie die Platte mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Beschichtete Platten können maximal eine Woche bei 4 °C gelagert werden.
>4. Wartung von iPS-Zellen
- Bereiten Sie mit Basalmembranmatrix beschichtete Gerichte zu, wie bereits in Schritt 3.2 erwähnt.
- Saugen Sie das mTeSR Plus medium vollständig an. Waschen Sie die Vertiefung einmal mit PBS und fügen Sie 0,5 ml Übergabereagenz hinzu (siehe Materialtabelle). Warten Sie einige Sekunden und saugen Sie die Lösung an.
- Die Platte wird bei 37 °C im Inkubator 5 Minuten lang inkubiert oder bis die Zellen rund werden.
Anmerkung: Die Inkubationszeit kann zwischen verschiedenen iPS-Zelllinien und der Konfluenz variieren. Bitte überprüfen Sie regelmäßig unter dem Mikroskop, um die Dissoziationszeit während der Inkubation zu bestimmen.
- Fügen Sie 1 mL mTeSR Plus Medium hinzu und klopfen Sie 30-60 s lang auf die Platte, um die Kolonien zu lösen.
- Mischen Sie vorsichtig 1 ml der Zellsuspensionslösung mit 7 ml frischem mTeSR plus Medium. Pipettieren Sie nicht mehr als 5 Mal.
- Plattieren Sie im Verhältnis 1:8. In der Regel wird 1 ml der Suspension aus Schritt 5.5 zugegeben und 1 ml mTeSR plus Medium mit 5-10 μM Y-27632 (ROCK-Inhibitor) hinzugefügt. Das Verdünnungsverhältnis des Durchgangs hängt von der iPSC-Leitung ab.
- Stellen Sie die Zelle in einen 5 % CO2/37 °C Inkubator. Entfernen Sie Y-27632 am nächsten Tag durch Zugabe von frischem mTeSR Plus Medium. Wechseln Sie danach zunächst alle zwei Tage das Medium und jeden Tag, wenn die Zelle eine höhere Konfluenz erreicht.
>5. Differenzierung von iPS-Zellen in Motoneuronen
- Passage iPSC für die Differenzierung von Motoneuronen
Anmerkung: Die Differenzierung kann erfolgreich im 3D-Protokoll (5.2) durchgeführt werden.
- Lassen Sie undifferenzierte iPS-Zellen wachsen, bis sie eine Konfluenz von ca. 80 % im mTeSR Plus-Medium in einer 6-Well-Platte erreichen.
- Saugen Sie das Medium vollständig an. Waschen Sie die Vertiefung sofort einmal mit sterilem PBS und geben Sie 0,5 ml Zelldissoziationslösung in die Zellen.
- Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C im Inkubator für ca. 2-3 Minuten oder bis die Zellen getrennt und rund sind, aber an der Vertiefung haften.
- Fügen Sie 1 ml Medium hinzu und pipettieren Sie mit einer serologischen 5-ml-Pipette einige Male vorsichtig auf und ab. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen, das aus 4 mL des Mediums besteht.
- Bei 200 x g für 3 min zentrifugieren.
- Den Überstand vorsichtig ansaugen, das Pellet ungestört lassen, und die Zellen in 1 ml des mit 10 μM Y-27632 zugesetzten Mediums resuspendieren.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und fahren Sie mit 5.2 (3D-Differenzierung) fort.
- Bildung von Motoneuronen-Sphäroiden (MNS) in der 3D-Differenzierung ("3D-Protokoll")
Anmerkung: Ein kompletter Mediumwechsel wird täglich von den Tagen 0-12 der Differenzierung durchgeführt (Abbildung 2).
- Säen Sie die iPS-Zellen aus Schritt 5.1.7 auf eine 96-Well-U-Bodenplatte mit 40.000 Zellen/Well in 100 μl mTeSR Plus, ergänzt mit 10 μM Y-27632.
- Ersetzen Sie am nächsten Tag jede Vertiefung durch 100 μl des frischen Mediums.
- An den Tagen 0 und 1: Das Nährmedium wird aspiriert und durch 100 μl KSR-Medium (3.1.2) ersetzt, das mit 10 μM SB431542 und 100 nM LDN-193189 ergänzt wird.
- An den Tagen 2 und 3: Aspirieren Sie das Nährmedium und ersetzen Sie es durch 100 μl KSR-Medium, das mit 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA und 1 μM SAG ergänzt wird.
- An den Tagen 4 und 5: Bereiten Sie ein Mischmedium zu, das aus 75 % KSR-Medium und 25 % N2-Medium besteht (3.1.3). Aspirieren Sie dann das Kulturmedium und ersetzen Sie es durch 100 μl Mischmedium, das mit 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA und 1 μM SAG ergänzt wird.
- An den Tagen 6 und 7: Bereiten Sie ein Mischmedium vor, das aus 50 % KSR-Medium und 50 % N2-Medium besteht. Aspirieren Sie dann das Kulturmedium und ersetzen Sie es durch 100 μl Mischmedium, das mit 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM Retinsäure und 1 μM SAG ergänzt wird.
- An den Tagen 8 und 9: Bereiten Sie ein Mischmedium vor, das aus 25 % KSR-Medium und 75 % N2-Medium besteht. Anschließend wird das Kulturmedium aspiriert und durch 100 μl Mischmedium ersetzt, das mit 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA und 1 μM SAG ergänzt wird.
- An den Tagen 10 und 11: Ersetzen Sie das Medium durch 100 μl N2-Medium, ergänzt mit 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA und 1 μM SAG.
- An Tag 12: Mit dem Transfer der MNs in den Gewebekulturchip fortfahren (Schritt 6) oder das Medium durch 100 μl des Reifungsmediums (3.1.4) ersetzen, ergänzt mit 20 ng/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
Anmerkung: Das MNS kann ab dem 12. bis zum 19. Tag auf den Gewebekulturchip übertragen werden. Sphäroide, die nicht übertragen werden, sollten bis zum Transfer in 96-Well-U-Bodenplatten in Reifungsmedium kultiviert werden, das mit 20 ng/mL BDNF ergänzt ist.
>6. Vorbereitung des Gewebekulturchips für die Bildung von motorischen Nervenorganoiden (MNO)
- Sterilisieren Sie das vorbereitete PDMS (aus Schritt 2.13), indem Sie es mindestens 1 h.
in 70%iges Ethanol in der Petrischale tauchen
Anmerkung: Alle folgenden Schritte sollten in einer Biosicherheitswerkbank bearbeitet werden.
- Sterilisieren Sie das Mikroskopglas (76 x 52 mm), indem Sie es in der Petrischale in 70%iges Ethanol tauchen.
- Während des Trocknungsprozesses des Mikroskopglases legen Sie das PDMS-Gerät auf das halbnasse Mikroskopglas und lassen Sie es über Nacht vollständig trocknen. Sobald es vollständig getrocknet ist, sollte das PDMS-Gerät auf dem Glas haften.
Anmerkung: Diese Verklebung ist nicht dauerhaft, um ein Ablösen der PDMS-Geräte vom Mikroskopglas nach der Kultur für die Gewebeentnahme zu ermöglichen. Die dauerhafte Bindung durch Sauerstoffplasma kann verwendet werden, um die Adhäsion zwischen PDMS und Glas zu maximieren, würde jedoch die Demontage der Chips und die Gewebesammlung verhindern.
- Beschichten Sie die Oberfläche des Mikrokanals mit PDMS-Geräte- und Mikroskopglas mit 30 μl verdünnter Basalmembranmatrix in DMEM/F12 (1:40), indem Sie auf einer Seite des Einlasses des Kanals einen Tropfen erzeugen und dann die Lösung von der anderen Seite des Einlasses mit einer Pipette oder Saugpumpe aspirieren (Abbildung 3A). Saugen Sie nicht zu viel Volumen der Lösung an, um eine Kontamination der Blasen zu vermeiden.
- Inkubieren Sie das PDMS-Gerät dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C in einem Sekundärbehälter (z. B. Petrischale).
>7. Bildung von motorischen Nervenorganoiden (MNO)
- Ersetzen Sie die Beschichtungslösung durch vorgewärmte 150 μl Reifungsmedium, das kurz vor der Verwendung mit 20 ng/ml BDNF zugesetzt wird.
- Platzieren Sie dann das MNS aus Schritt 5.2.9 mit einer Mikropipette mit breiter Spitze in den Einlass des Mikrokanals. MNS können sich durch die Schwerkraft spontan am Boden des Geräts absetzen. Üben Sie nicht zu viel Druck aus, wenn Sie das MNS injizieren (Abbildung 3B).
Anmerkung: Wenn das MNS an der Seitenwand eines Lochs in einem Gewebekulturchip hängen bleibt, saugen Sie die Lösung vorsichtig von einer anderen Seite des Einlasses an.
- Füllen Sie ein kleines Reservoir (z. B. einen Deckel mit 15 ml Röhrchen) mit sterilem Wasser und platzieren Sie es in der Nähe des Gewebekulturchips im Sekundärbehälter, um eine Verdunstung des Mediums zu verhindern. Legen Sie es dann in einen Inkubator mit 5 % CO2/37 °C.
- Für einen Medienwechsel aspirieren Sie das erschöpfte Kulturmedium aus der Mitte des Mediumreservoirs (Abbildung 3C). Aspirieren Sie nicht das gesamte Medium und das Gewebe.
- Frisches Reifemedium (mit BDNF) vorsichtig zugeben. Das Medium sollte alle 2-3 Tage gewechselt werden. Trocknen Sie das Kulturmedium zu keinem Zeitpunkt während der Kultur. Axone wachsen von einem MNS in den Kanal und fügen sich innerhalb von 2-3 Wochen spontan zu einem einzigen Bündel zusammen, was zur Bildung eines MNO führt. MNO kann länger als 1 Monat in dem Gerät kultiviert werden.
