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>1. Zellkulturen und Vordifferenzierung
- Neuronale Stammzellkultur und Prädifferenzierung
- Bereiten Sie Poly-D-Lysin-beschichtete Deckgläser vor. Legen Sie ein steriles Deckglas (20 mm Durchmesser) in eine 12-Well-Platte. Beschichten Sie das Deckglas mit Poly-D-Lysin, 0,1 % w/v, in Wasser, um eine bessere Zellhaftung auf den Deckgläsern zu gewährleisten, indem Sie die nächsten Schritte befolgen.
HINWEIS: Für jede Zelllinie und Anwendung müssen optimale Bedingungen ermittelt werden.
- Die Oberfläche des Deckglases aseptisch mit Poly-D-Lysin, 0,1 % w/v, in Wasser bestreichen. Sanftes Schaukeln, um eine gleichmäßige Beschichtung der Deckglasoberfläche zu gewährleisten.
- Nach der Kultivierung über Nacht (~12 h) bei 37°C die Poly-D-Lysin-Lösung entfernen und die Oberfläche 3x mit 1 mL sterilem Wasser abspülen.
- Trocknen Sie die Zellen mindestens 30 Minuten, bevor Sie sie aussäen.
- Kultur und Prädifferenzierung von neuralen Stammzellen der Maus C17.2 (C17.2-NSC)
- Inkubieren Sie C17.2-NSCs in einem 25 cm2 Kolben in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 5 % Pferdeserum (HS) und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 °C und 5 % CO2 für ~2 - 3d.
- Wenn die Zellen eine Konfluenz von 85 % erreichen, entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS und geben Sie 1 ml frisches Trypsin (0,25 %) in den Kolben. Lassen Sie es 1 Minute einwirken; Geben Sie dann 1 ml Kulturmedium in den Kolben und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
- Zählen Sie die Dichte der Zellen in der Suspension mit einem Hämozytometer. Berechnen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension, um eine endgültige Zellkonzentration von 2 x 104 Zellen/ml zu erhalten.
- Aussaat der C17.2-NSCs auf den beschichteten Deckgläsern in der 12-Well-Platte mit einer Dichte von ~2 x 104 Zellen pro Well. Überprüfen Sie die Zelldichte unter dem Mikroskop.
HINWEIS: Für ein besseres Ergebnis muss die optimale Zelldichte vor dem Immunfluoreszenzexperiment bestimmt werden.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem Zellinkubator für 12 Stunden, um eine Anheftung zu ermöglichen.
- Nach der Anheftung die Zellen 2x mit 1 mL PBS waschen und die Zellen mit einem Differenzierungsmedium bestehend aus DMEM/F12 mit 1% N2 Zugabe für 48 h vor der Plasmabehandlung kultivieren.
- Primäre neurale Stammzellkultur und Prädifferenzierung von Ratten
- Die primäre Suspension der Ratten-NSC (neurale Stammzellen) in Ratten-NSC-Wachstumsmedium in unbeschichteten T25-Kolben bei einer Dichte von 5 x 105 Zellen kultivieren.
- Überprüfen Sie die Bildung von Neurosphären unter einem inversen Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Morphologie der Neurosphären kugelförmige und transparente mehrzellige Komplexe aufweist.
- Wenn die Neurosphären einen Durchmesser von 3 mm oder größer erreichen, übertragen Sie die Neurosphärensuspension in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen und lassen Sie die Neurosphären durch die Schwerkraft absetzen.
- Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um die Neurosphären in einem minimalen Volumen des Mediums zu belassen.
- Spülen Sie die Neurosphären 1x mit 5 mL PBS und lassen Sie die Neurosphären durch die Schwerkraft zur Ruhe kommen. Entfernen Sie den Überstand, um ein minimales Volumen an PBS zu erhalten.
- Fügen Sie ein geeignetes Volumen des Differenzierungsmediums hinzu, um die Zelldichte auf ~12 - 15 Neurosphären pro Milliliter einzustellen. Das Differenzierungsmedium für primäre NSCs der Ratte besteht aus DMEM/F12, 2 % B27 und 1 % FBS.
- 1 ml Neurosphärensuspension auf jedes beschichtete Deckglas in der 12-Well-Platte aussäen.
HINWEIS: Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Neurosphären gleichmäßig verteilt sind. Dieser Schritt ist entscheidend für ein besseres Immunfluoreszenzergebnis.
- Legen Sie die Platte in den Inkubator und lassen Sie sie vor der Plasmabehandlung 24 Stunden lang vordifferenzieren.
>2. Vorbereitung der Plasmastrahlen
- Wählen Sie ein halboffenes Quarzrohr mit einem Innendurchmesser von 2 mm und einem Außendurchmesser von 4 mm. Führen Sie einen Hochspannungsdraht mit einem Durchmesser von 2 mm in das Rohr ein.
- Führen Sie das Quarzrohr mit dem Hochspannungsdraht in eine 5-ml-Spritze ein und befestigen Sie es mit einer Halterung in der Mitte der Spritze. Stellen Sie den Abstand zwischen dem versiegelten Ende des Quarzrohrs und der Spritzenspitze auf 1 cm ein.
- Schließen Sie ein 1 m langes Silikonkautschukrohr (mit einem Innendurchmesser von 12 mm) an das offene Ende der Spritze an und verbinden Sie es dann nacheinander mit dem Durchflussmesser und dem Gasventil.
>3. Erwerb der Jets
- Schließen Sie den Stromkreis wie in Abbildung 1 gezeigt an. Verbinden Sie das Ausgangskabel des Netzteils mit dem Plasmastrahlgerät und verbinden Sie dann die Spitze der Hochspannungssonde mit dem Ausgangskabel, um die Spannung zu erfassen. Verbinden Sie das andere Ende des Hochspannungstastkopfes mit dem Oszilloskop, um die Informationen der Ausgangsspannung aufzuzeichnen. Überprüfen Sie die gesamte Schaltung und stellen Sie sicher, dass das Netzteil, das Oszilloskop und der Hochspannungstastkopf geerdet sind.
- Überprüfen Sie die Gasleitung. Stellen Sie sicher, dass der Gasschlauch an das Plasmastrahlgerät angeschlossen ist. Öffnen Sie dann das Gasventil des Heliums (Volumenanteil, 99,999 %) und des Sauerstoffs (Volumenanteil, 99,999 %) und stellen Sie den Gasfluss auf 1 L : 0,01 L/min (He:O2) ein.
HINWEIS: Lassen Sie das Gas einige Minuten lang fließen, bevor Sie die Stromversorgung zum ersten Mal einschalten.
- Stellen Sie die Impulsamplitude, -frequenz und -breite auf 8 kV, 8 kHz bzw. 1600 ns ein. Überprüfen Sie den Stromkreis erneut und schalten Sie dann die Ausgabetaste ein, um einen Plasmastrahl zu erzeugen.
ACHTUNG: Berühren Sie zu keinem Zeitpunkt das Hochspannungskabel.
>4. Plasmabehandlung von neuralen Stammzellen
- Stellen Sie den Abstand zwischen der Düse der Spritze und dem Loch der Zellenvertiefung auf 15 mm ein.
HINWEIS: Der Abstand wird von der Unterseite der Plattform gemessen, auf der die 12-Well-Platte platziert ist.
- Nehmen Sie die 12-Well-Platte aus dem Inkubator und wechseln Sie das Medium der vordifferenzierten Zellen auf 800 μl frisches Differenzierungsmedium.
- Teilen Sie die Zellen in drei Gruppen ein: eine unbehandelte Kontrollgruppe, eine 60 s He-und-O2 (1%) Gasflussbehandlungsgruppe und eine 60 s Plasmabehandlungsgruppe.
HINWEIS: Unter den Behandlungsbedingungen gibt es keinen offensichtlichen Flüssigkeitsverlust.
- Platzieren Sie die 12-Well-Platte unter den Plasmastrahlen, stellen Sie sicher, dass die Spritzendüse in der Mitte jedes Lochs fixiert ist, und führen Sie die entsprechende Behandlung für die verschiedenen Gruppen durch, die in Schritt 4.3.
HINWEIS: Die unbehandelten Kontrollen wurden während des experimentellen Verfahrens in einem Differenzierungsmedium bei Raumtemperatur aufbewahrt, um einheitliche Behandlungsbedingungen zu gewährleisten. Die He-und O2-Gasflussbehandlungsgruppe (1 %) wurde nur mit einem He-und O2 (1 %) Gasstrom ohne Plasmaerzeugung behandelt. Alle Behandlungen sollten in dreifacher Ausfertigung durchgeführt werden.
>5. Differenzierung neuronaler Stammzellen
- Entfernen Sie nach der Behandlung die ursprüngliche Kultur und geben Sie 1 ml neues Differenzierungsmedium in jede Vertiefung
.
- Inkubieren Sie die Zellen im Inkubator bei 37°C und 5% CO2 für 6 Tage. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag.
- Überprüfen Sie täglich den Differenzierungsstatus der verschiedenen Gruppen unter einem inversen Phasenkontrastlichtmikroskop Abbildung 2. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip mindestens 12 Felder aus und machen Sie Fotos, um die morphologischen Veränderungen festzuhalten.
