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>1. Vorbereitung der Medien
HINWEIS: Alle Medien auf 37 ° erwärmen; C vor der Verwendung in Zellkultur.
Medium für - embryonale Fibroblasten (MEF) der Maus (zur Herstellung von 500 ml)
- Geben Sie 50 mL fötales Rinderserum (FBS) zu 449 mL Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) und filtrieren Sie durch eine 500 mL 0,22 μm Porenfiltereinheit.
- Fügen Sie nach der Filtration 1 ml antimikrobielles Mittel (50 mg/ml) hinzu. Lagern Sie das Medium bis zu 1 Monat bei 4 °C oder aliquot und lagern Sie es bei ≤ -20 °C.
- N2-Medien (zur Vorbereitung von 500 mL)
- Geben Sie 5 mL L-Alanin-L-Glutamin (100x) und 500 μL 2-Mercaptoethanol (55 mM) zu 489,5 mL DMEM: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) und filtrieren Sie durch eine 500 mL 0,22 μm Porenfiltereinheit.
- Nach der Filtration 1 ml antimikrobielles Mittel (50 mg/ml) und 5 ml N2-Supplement-B hinzufügen. Lagern Sie das Medium bei 4 °C im Dunkeln bis zu 1 Monat.
- Serumfreies Wachstumsmedium (KSR) (zur Herstellung von 500 mL)
- Fügen Sie 75 ml serumfreies Medium, 5 ml L-Glutamin (100x), 5 ml MEM-nicht-essentielle Aminosäuren (MEM-NEAA) (100x) und 500 μl 2-Mercaptoethanol (55 mM) zu 413,5 ml nicht-glutaminhaltigem DMEM hinzu und filtrieren Sie durch eine 500 ml 0,22 μm Porenfiltereinheit.
- Fügen Sie nach der Filtration 1 ml antimikrobielles Mittel (50 mg/ml) hinzu. Lagern Sie das Medium bis zu 1 Monat lang bei 4 °C.
- Medien für embryonale Stammzellen der Maus (zur Vorbereitung von 500 ml)
- Fügen Sie 75 ml FBS in Stammzellqualität, 5 ml MEM-NEAA (100x), 5 ml L-Glutamin (100x) und 500 μl 2-Mercaptoethanol (55 mM) zu 413,5 ml Nicht-Glutamin-haltigem DMEM hinzu und filtrieren Sie durch eine 500 ml 0,22 μm Porenfiltereinheit.
- Fügen Sie nach der Filtration 1 ml antimikrobielles Mittel (50 mg/ml) hinzu. Lagern Sie das Medium bis zu 1 Monat bei 4 °C im Dunkeln oder aliquot und lagern Sie es bei ≤ -20 °C.
>2. Kultivierung von mESCs
- Platten mitotisch inaktive MEF-Feederzellen in MEF-Medien auf gewebekulturbehandelte Platten bei 3-4 x 104 Zellen/cm2. Lassen Sie sie mindestens 12 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 absetzen, bevor Sie die mES-Zellen plattieren. Wenn Sie das MEF-Medium nicht sofort verwenden, ersetzen Sie es alle 3 Tage. Entsorgen Sie MEFs, wenn sie nicht innerhalb von 7 Tagen nach dem Plattieren verwendet werden.
- Fügen Sie mES-Zellen (Dichtebereich von 1-4 x 104 Zellen/cm 2) zu MEF-Platten in mESC-Medien hinzu, die den Maus-Leukämie-Hemmfaktor (mLIF) (1.000 U/ml) enthalten. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.
- Passage mESCs mit Trypsin-EDTA (0,05% Trypsin) (1:5-1:10), sobald die Schale ~ 70-80% konfluent wird oder wenn die Kolonien beginnen, sich zu berühren. Dies geschieht in der Regel alle 2 Tage, kann aber je nach anfänglicher Beschichtungsdichte bis zu 4 oder 5 Tage dauern.
- Bewahren Sie die mES-Zellen auf einer MEF-Feeder-Schicht in einem mESC-Medium auf, um die Pluripotenz zu erhalten.
- Bevor Sie mit der Differenzierung beginnen, passieren Sie die Zellen mindestens einmal auf gelatinebeschichtete Platten ohne MEFs, um die MEFs zu verdünnen.
- Bereiten Sie mit Gelatine beschichtete Platten vor, indem Sie 0,1 % Gelatine in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2+/Mg2+ in eine mit Gewebekultur behandelte Schale geben und mindestens 1 h bei 37 °C stehen lassen. Platte 1,5-2 x 106 Zellen/10 cm Platte (2,7-3,6 x 104 Zellen/cm 2) und lassen Sie die Zellen 2 Tage lang expandieren, bevor Sie mit der Differenzierung beginnen.
>3. Differenzierung von mESCs gegenüber MGE-ähnlichen Telencephalen Vorläuferzellen
- Differenzierungstag (DD) 0 = "Gleitkommazellen"
- Nachdem die mES-Zellen 2 Tage lang auf gelatinebeschichteten Platten gewachsen sind, aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS ohne Ca2+/Mg2+. Fügen Sie so viel Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) hinzu, dass die Oberfläche der Platte bedeckt ist (typischerweise 4 ml Trypsin-EDTA für eine 10-cm-Gewebekulturschale) und legen Sie die Zellen wieder in den Inkubator bei 37 °C mit ≥95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 4 Minuten.
- Nach 4 min wird das Trypsin-EDTA mit dem 2-fachen Volumen mit mESC-Medien abgeschreckt. Übertragen Sie die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen mit geeigneter Größe und zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min. Entfernen Sie nach 5 Minuten den Schlauch und saugen Sie das Medium an, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL KSR:N2-Medium (1:1), das den BMP-Inhibitor LDN-193189 (250 nM) und den Wnt-Inhibitor XAV-939 (10 μM) enthält.
- Messen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Beginnen Sie mit der Züchtung von Zellen als Embryoidkörper (EBs), indem Sie 75.000 Zellen/ml in KSR:N2-Medien (1:1) mit LDN-193189 (250 nM) und XAV-939 (10 μM) in nicht-adhärenten Gewebekulturschalen hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.
- Bereiten Sie auf DD1 die "Landung" der Zellen vor, indem Sie mit Gewebekulturen behandelte Schalen über Nacht (O/N) bei 37 °C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit oder für mindestens 1 h mit Poly-L-Lysin (10 μg/ml in PBS mit Ca2+/Mg2+) beschichten.
- Auf DD2 wird das Poly-L-Lysin aspiriert und die Platten mit Laminin (10 μg/mL in PBS mit Ca2+/Mg2+) O/N bei 37 °C und ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit bestreut.
Anmerkung: Während O/N optimal ist, können bereits 2 h ausreichend sein. Wenn die Platten bis zum nächsten Tag nicht verwendet werden, aspirieren Sie Laminin, ersetzen Sie es durch PBS ohne Ca2+/Mg2+ und lagern Sie es bis zu 2 Wochen lang bei 4 °C.
- DD3 ("Landzellen")
- Bevor Sie mit der EB-Dissoziation beginnen, aspirieren Sie das Laminin und lassen Sie die Platten in einer Gewebekulturhaube vollständig trocknen. Verwenden Sie keine Platten, die glänzend oder sichtbar nass erscheinen. Die EBs mit dem Medium in ein 15-ml-Röhrchen geben und 3-4 min bei 15 x g zentrifugieren oder bis die EBs pelletiert sind.
- Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 3 ml Zellablösung, die DNase (2 U/ml) enthält, hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 °C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2. Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig alle 3 Minuten, um die EB-Dissoziation zu unterstützen.
- Sobald die EBs nicht mehr sichtbar sind oder 15 Minuten verstrichen sind, fügen Sie 6 mL KSR:N2 (1:1) mit DNase (1 U/mL) hinzu und zentrifugieren Sie 5 min lang bei 200 x g.
- Plattieren Sie die Zellen in KSR:N2 (1:1), die LDN-193189 (250 nM), XAV-939 (10 μM) und den ROCK-Inhibitor Y-27632 (10 μM) enthalten, bei 4,5-5 x 104 Zellen/cm2.