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>1. mESC-Kultur
- Bestreichen Sie eine 10 cm große, mit Gewebekulturen behandelte Platte mit 0,1 % Gelatine und lassen Sie die Gelatine mindestens 15–30 Minuten lang aushärten, bevor Sie sie herausziehen.
- Säen Sie γ-bestrahlte embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus einen Tag vor der Kultivierung der mESCs im vorgewärmten mESC-Medium aus (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 15 % fötalem Rinderserum (FBS), nicht-essentiellen Aminosäuren, β-Mercaptoethanol, L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin, Natriumpyruvat, Leukämie-Hemmfaktor (LIF), PD0325901 (PD) und CHIR99021 (CH)).
- Lassen Sie die γ-bestrahlten MEFs sich absetzen und an der Plattenoberfläche anlagern, bevor Sie E14-Zellen kultivieren.
- Tauen Sie die E14-Regler in einem 37 °C warmen Wasserbad auf und übertragen Sie die Zellen schnell in ein 15 cm konisches Röhrchen mit warmem mESC-Medium. Pelletieren Sie die Zellen bei 200 x g für 3 min und entfernen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml mESC-Medium und plättieren Sie die Zellen auf der Kulturplatte mit den zuvor γ-bestrahlten MEFs. Inkubieren Sie die Zellkultur in einem 37 °C heißen Inkubator unter 5 % CO2.
- Für die Kulturpassage aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Platte mit steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Fügen Sie so viel 0,05 % Trypsin hinzu, dass die Plattenoberfläche bedeckt ist, und inkubieren Sie sie 3 Minuten lang bei 37 °C.
- Neutralisieren Sie das Trypsin mit mESC-Medium und pipettieren Sie, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Die Zellen bei 200 x g 3 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder Zellzähler und säen Sie ca. 5,0 x 105 Zellen in eine 10 cm Kulturplatte.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml mESC-Medium, plattieren Sie die Zellen auf der gelatinebeschichteten Gewebekulturplatte und inkubieren Sie die Kulturen wie zuvor beschrieben.
Anmerkung: Es wird empfohlen, mES-Zellen alle 2 Tage zu passagen, um zu verhindern, dass sich die Zellen in ihren Kolonien differenzieren. Phenolrot im Medium fungiert ausschließlich als pH-Indikator und kann je nach Zelldichte früher als 2 Tage gelblich (saurer) werden. Daher kann es notwendig sein, das Medium täglich zu wechseln. Die γ-bestrahlten MEFs sterben schließlich nach ein paar Durchgängen ab.
>2. EB-, NPC- und Neuronendifferenzierung
- Führen Sie ein Kulturpassageprotokoll durch und zählen Sie die Zellen.
- Hanging Drop-Methode (Tag 0)
- Für eine 10-cm-Zellkulturplatte zählen Sie etwa 2,5 x 104 Zellen, wobei 5,0 x 102 Zellen in 20 μl Differenzierungsmedium suspendiert werden (DMEM mit 15 % FBS, nicht-essentiellen Aminosäuren, β-Mercaptoethanol, L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin und Natriumpyruvat). Etwa fünfzig 20-μl-Tröpfchen, die die Zellen enthalten, können auf einer 10-cm-Platte plattiert werden.
- Aliquotieren Sie die entsprechende Anzahl von Zellen, zentrifugieren Sie die Zellen dann 3 Minuten lang bei 200 x g und entfernen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Zellen in dem entsprechenden Volumen des Differenzierungsmediums für eine Zelldichte von 5,0 x 102 Zellen pro 20 μl (z. B. 2,5 x 104 Zellen in 1 ml Differenzierungsmedium).
- Geben Sie mit einer Mikropipette oder einer Repeaterpipette 20 μl Tröpfchen der Zellsuspension auf den Deckel der Gewebekulturplatte. Achten Sie darauf, dass die Tröpfchen nicht zu nahe beieinander liegen, um ein Verschmelzen zu verhindern.
Anmerkung: Die Tröpfchen können entweder auf einer mit Gewebekultur behandelten Aufsatzplatte oder einer Suspensionsplatte plattiert werden, da sie auf dem Deckel und nicht auf der Platte selbst platziert werden. Für einen praktikableren und sterileren Ansatz plattieren Sie die Tröpfchen auf einer Gewebekulturplatte und übertragen Sie sie auf eine Suspensionsplatte, wie unten beschrieben.
- Füllen Sie die Platte mit 5–10 mL 1x PBS und setzen Sie den Deckel vorsichtig wieder auf die Platte. Inkubieren Sie die Kultur im 37 °C Inkubator.
Anmerkung: PBS wird der Kulturplatte zugesetzt, um ein Austrocknen der Tröpfchen zu verhindern.
- Verwenden Sie an Tag 2 eine Mikropipette, um die Tröpfchen vom Deckel zu sammeln, und geben Sie sie in eine 10 cm große Zellkultur-Suspensionsplatte, die mit 10 ml Differenzierungsmedium gefüllt ist. Inkubieren Sie die Kultur auf einem Orbitalschüttler und schütteln Sie ihn bei niedriger Geschwindigkeit im Inkubator.
- An Tag 4, um die EBs zu ernten, die Zellen sammeln, 3 min bei 200 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen.
Anmerkung: Die EBs können auch mit 1x PBS gewaschen werden, je nach den Anforderungen der nachfolgenden Experimente.
- Um das Verfahren fortzusetzen und die EB-Differenzierung in neurale Vorläuferzellen (NPCs) zu induzieren, bereiten Sie das Differenzierungsmedium mit 5 μM Retinsäure (RA) vor.
- Entfernen Sie das alte Medium, indem Sie die EBs bei 100 x g für 3 min pelletieren oder lassen Sie die EBs absetzen, bevor Sie das alte Medium absaugen. Geben Sie 10 mL des Differenzierungsmediums mit 5 μM RA in die Kulturplatte.
- Ersetzen Sie an Tag 6 mindestens die Hälfte des Mediums durch frisches Medium mit 5 μM RA, indem Sie die Platte kippen und das Medium wie oben beschrieben herauspipettieren.
Anmerkung: Es wird empfohlen, an den Tagen 5 und 7 mindestens die Hälfte des Mediums durch frisches RA-haltiges Medium zu ersetzen. Beachten Sie den Phenolrot-Indikator; Wenn es gelblich wird, ist es am besten, das gesamte Medium auszutauschen.
- Ernte an Tag 8 die NPCs, indem du die Zellen sammelst, 3 Minuten lang bei 200 x g zentrifugierst und den Überstand entfernst.
Anmerkung: Die NPCs können auch mit 1x PBS gewaschen werden, je nach Bedarf für nachfolgende Experimente. Bei Bedarf können NPCs eingefroren und wieder aufgetaut werden, um sie später zu kultivieren und zu analysieren. Sollen die NPCs kultiviert werden, kann Accutase auch als Alternative zu Trypsin eingesetzt werden.