Direkte Reprogrammierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen in neurale Stammzellen

Zusammenfassung

Quelle: Wang, T., et al. Direkte Induktion menschlicher neuronaler Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen des peripheren Blutes. J. Vis. Exp, (2015)

Dieses Video zeigt die direkte Reprogrammierung von genetisch veränderten hämatopoetischen Vorläuferzellen in neuronale Stammzellen. Transkriptionsfaktoren, die von hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert werden, lösen eine Kaskade von molekularen Ereignissen aus, die ihre Umwandlung erleichtern. Weitere spezifische Medien werden verwendet, um induzierte neuronale Stammzellen zu selektieren und zu züchten.

Protokoll

>1. Induktion neuraler Stammzellen

HINWEIS: Abhängig von den Zellbedingungen erreichen Monolayer-adhärente Zellen etwa 5 oder 7 Tage nach der Transfektion eine Konfluenz von 30 - 50% (Abbildung 1C).

1. Entfernen Sie die Überstände, die schwimmende Zellen und Kugeln enthalten, und geben Sie dann 1 ml neurales Vorläufermedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12), das 1x N2-Supplement, 0,1 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA), 1 % (v/v) Antibiotika, 20 ng/ml basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und 20 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)) in die adhärenten Zellen enthält.
2. Optional können Sie die Zellkugeln dissoziieren, indem Sie die Zellen 10 Minuten lang vorsichtig bei 170 x g pipettieren und zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml neuralem Vorläufermedium in einer neuen 24-Well-Platte, die mit Matrigel beschichtet ist, pro Anweisung als Backup.
3. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis die Zellen 60 - 80% konfluent sind, normalerweise nach 1 Woche.
4. Den Überstand verwerfen und 1 ml neurales Stammzellmedium (serumfreies Medium, NSC SFM) zugeben. Dissoziieren Sie die Zellen mit einem Zellschaber, gefolgt von einem sehr schonenden Pipettieren.
5. Entfernen Sie die Zellen und säen Sie sie alle in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Fügen Sie weitere 1 ml neuronales Stammzellmedium hinzu, um 2 ml Medium für jede Vertiefung herzustellen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5 % CO₂ -Inkubator.
6. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag.
7. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 60 % erreichen, dissoziieren Sie die Zellen und plattieren sie erneut im Verhältnis 1:3, indem Sie die Schritte in 1.4 und 1.6 befolgen.

Ergebnisse

Abbildung 1. Morphologische Veränderungen von CD34-Zellen nach Transfektion des Sendai-Virus. (A) Zum Zeitpunkt der Transfektion kann eine signifikante Anzahl von CD34-Zellen beobachtet werden. (B) Kugelartige Zellaggregate können 24 Stunden nach der Transfektion des Sendai-Virus beobachtet werden, die sich im Laufe der Zeit ausdehnen. (C) Meist t...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Abstreifer für Zellen	Sarstedt	83.183
DMEM/F12	Lebenstechnologien	Nr. 12400-024	1-mal
N2-Ergänzung	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 17502-048	1-mal
Rinderserumalbumin	Sigma	Nr. A2934	0,1 % (w/v)
bFGF	Peprotech	100-18 Mrd.	20 ng/ml
EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 Beilage	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 17504-044	1-mal
NSC-Serum freies Medium	Lebenstechnologien	A1050901	1-mal