siRNA-vermitteltes Gen-Silencing in neuralen Stammzellen

Zusammenfassung

Quelle: Nguyen, B. H., et al. Kultivierung und Manipulation von O9-1 Neuralleistenzellen. J. Vis. Exp (2018)

Dieses Video demonstriert die Verwendung von small interfering RNA (siRNA), um spezifische Gene von Interesse in neuralen Stammzellen zum Schweigen zu bringen und sie unter Verwendung eines geeigneten Differenzierungsmediums in gewünschte Zelltypen zu differenzieren. Dieses Verfahren ermöglicht es, die entscheidende Rolle spezifischer Gene im Differenzierungsprozess von neuralen Stammzellen zu untersuchen.

Protokoll

>1. Manipulation von O9-1-Zellen

1. Durchführung des siRNA-Knockdowns in O9-1-Zellen
   1. Tauen Sie eine 24-Well-Platte auf und beschichten Sie sie mit einer Basalmembranmatrix, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Regenerieren und säen Sie O9-1-Zellen aus, so dass sie auf eine Konfluenz von 60 % bis 80 % anwachsen können.
   2. Verdünnen Sie die Liposomen in serumfreien Medien entsprechend dem entsprechenden Well-Volumen. siRNA in serumfreien Medien bis zum Finale verdünnen. Fügen Sie verdünnte siRNA zu verdünnten Liposomen in einem vom Hersteller empfohlenen Verhältnis hinzu. Durch Pipettieren gut mischen und dann inkubieren.
      Anmerkung: Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zu dem verwendeten Volumen, der Zeit und der Temperatur der Inkubation.
   3. Geben Sie den Zellen ein angemessenes Volumen des siRNA-Lipid-Komplexes gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
   4. Inkubieren Sie die Zellen 24 h lang in einem Standard-Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO₂). Führen Sie nach Bedarf nachgelagerte Schritte durch (RNA-Extraktion, Extraktion von Proteinen, Färbung usw.)
      HINWEIS: Die Knockdown-Zeiten und -Konzentrationen von siRNA können je nach Experiment variieren.

>2. Differenzierung von O9-1-Zellen

1. Differenzierung von O9-1-Zellen zu Osteoblasten
   1. Zur Herstellung von osteogenen Differenzierungsmedien verdünnen Sie Folgendes in alpha-MEM (Endkonzentrationen sind angegeben): 0,1 μM Dexamethason, 100 ng/ml knochenmorphogenetisches Protein 2 (BMP2), 50 μg/ml Ascorbinsäure, 10 mM b-Glycerophosphat, 10 % FBS, 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin.
   2. Nachweis des Osteoblastenmarkers Osteocalcin in differenzierten Osteoblasten durch Immunfärbung, wie in Abbildung 1.
      gezeigt HINWEIS: Die osteogene Differenzierung kann auch mit anderen Markern von Osteoblasten oder mit Alizarinrot-Färbung oder alkalischer Phosphatase-Färbung beurteilt werden.
2. Differenzierung von O9-1-Zellen in glatte Muskelzellen
   1. Zur Herstellung von Differenzierungsmedien für glatte Muskelzellen verdünnen Sie Folgendes in DMEM (Endkonzentrationen sind angegeben): 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10 % FBS.
   2. Bewertet die Differenzierung von glatten Muskelzellen mit Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung von Antikörpern gegen Marker glatter Muskelzellen, wie z. B. Aktin der glatten Muskulatur (SMA), das in Abbildung 2 als Beispiel dargestellt ist.

Ergebnisse

Abbildung 1: Immunfluoreszenzfärbung des Osteoblastenmarkers Osteocalcin (Ocn), die darauf hindeutet, dass O9-1-Zellen unter osteogenen Differenzierungsbedingungen zu Osteoblastenzellen geführt haben. Die Zellen wurden mit dem Osteoblasten-Marker-Ocn-Antikörper (grün) gefärbt, und die Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Pfeile zeigen Ocn-positive Zellen an. Osteocalcin (Ocn,...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
O9-1 Maus Zelllinie der kranialen Neuralleiste	Millipore Sigma	Artikel-Nr.: SCC049
DMEM, hoher Glukosegehalt, kein Glutamin	Gibco	Tel.: 11960-044
DMEM, hoher Glukosegehalt	Hyklon	SH30243.01
FBS (fötales Rinderserum)	Millipore Sigma	ES-009-B
Penicillin - Streptomycin	Gibco	Nr. 15140-122
L-Glutamin 200mM (100X)	Gibco	Artikel-Nr.: 25030-081
Trypsin-EDTA 0,25 % in HBSS	Genesee Scientific	25-510
DPBS (Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) ohne Calcium oder Magnesium	Lonza	17-512F
MEM nicht-essentielle Aminosäuren (MEM NEAA) 100X	Gibco	Tel.: 11140-050
Natriumpyruvat (100mM)	Gibco	Artikel-Nr.: 11360-070
2-Mercaptoethanol	Sigma	Nr. M-7522
Rekombinanter humaner Fibroblasten-Wachstumsfaktor-basisch (rhFGF-basisch)	F&E-Systeme	Artikel-Nr.: 233-FB-025
Mitomycin C	Roche	10107409001
Matrigel-Matrize	Corning	356234
DMSO (Dimethylsulfoxid)	Millipore Sigma	MX1458-6
Lipofectamin RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 13778-075
Opti-MEM I (1-fach)	Gibco	Artikel-Nr.: 31985-070
Minimum essentielles Medium, Alpha 1X mit Earle-Salzen, Ribonukleosiden, Desoxyribonukleosiden und L-Glutamin	Corning	Artikel-Nr.: 10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA	Dharmacon	Nr. L-041057
ON-TARGETplus Non-Targeting-Pool	Dharmacon	Nr. D-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNA	Dharmacon	Nr. L-046247
FCS (fötales Kälberserum)
ITS (Insulin-Transferrin-Selen )
TGF-b3
Ascorbinsäure
BMP2 (morphogenetisches Protein 2 der Knochen)
Dexamethason
B-27 Zuschlag