Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
1. Isolierung von mutmaßlich induzierten neuronalen Vorläuferzellen (iNPC) Kolonien
- Einen Tag vor der Entnahme von iNPC-Kolonien eine 48-Well-Platte mit Laminin beschichten: Verdünnen Sie Laminin auf 1 μg/ml in Dulbecco's Phosphat-Buffered Saline (DPBS), geben Sie 300 μl der Lösung auf die Platten und halten Sie sie 24 Stunden lang bei 4 °C. Einen Tag später aspirieren Sie Laminin aus den Platten und geben 200 μl Neuroinduktionsmedien (1:1 DMEM/F-12:Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng/ml humaner Leukämie-Hemmfaktor, 3 μM CHIR99021, 2 μM SB431542) in die Vertiefungen.
- Waschen Sie die 6-Well-Platten mit den zu pflückenden Kolonien einmal mit DPBS und fügen Sie 2 ml Neuroinduktionsmedium pro Vertiefung der 6-Well-Platte hinzu. Pflücken Sie die Kolonien mechanisch aus: Kratzen Sie mit einer dünnen Nadel um die Kolonien herum, um die umgebenden Zellen loszuwerden; Setzen Sie den 200 μl Pipettierer auf 50 μl und entnehmen Sie die Kolonien mit den entsprechenden Pipettenspitzen.
- Übertragen Sie jeweils eine Kolonie in eine Vertiefung einer lamininbeschichteten 48-Well-Platte und erzeugen Sie mechanisch eine Einzelzellsuspension, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Geben Sie den ROCK-Inhibitor Y27632 in einer Endkonzentration von 10 μM in die Zellen.
- Züchten Sie die Zellen auf der 48-Well-Platte bei 37 °C, 5 % CO2 für 2 Tage. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 - 90 % erreichen (ca. 3 - 4 Tage).
