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>1. Vorbereitung von 24-Well-Platten für Neuronenkulturen mit hoher Dichte
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte (2-3) am Tag vor der geplanten Entnahme von Embryonen durch.
- Bringen Sie zwei 24-Well-Platten in die Zellkulturhaube und öffnen Sie die Einzelverpackung.
- Verbinden Sie eine 18-G-Spritzennadel mit einer 1-ml-Einwegspritze aus Kunststoff.
- Halten Sie die Spritze fest und richten Sie die Nadelspitze in ~1 mm links zur Mitte des Bodens der Vertiefung. Wenden Sie mäßige Kraft (~250 g) an, um den Boden der Vertiefung (~1 mm lang) zu ätzen. Es wird eine Nut gebildet, und die verdrängten Kunststoffmaterialien bilden eine erhöhte Stütze über der Oberfläche des flachen Bodenschachts. Ätzen Sie auf ähnliche Weise eine weitere ~1 mm lange parallele Rille bei ~1 mm rechts von der Mitte des Bodens.
- Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Vertiefungen der beiden 24-Well-Platten. Die beiden 24-Well-Platten, die für die High-Density-Kultur verwendet werden, sind nun bereit für die Beschichtung mit Poly-D-Lysin (siehe Schritt 2.8 unten).
>2. Vorbereitung von Deckgläsern für Neuronenkulturen mit niedriger Dichte
- Verwenden Sie rundes Glas #1 mit einem Durchmesser von 12 mm.
- Legen Sie 50 Deckgläser in eine sterile Petrischale aus Kunststoff mit einem Durchmesser von 100 mm und tauchen Sie die Deckgläser in 20 ml 70%ige Ethanollösung. Stellen Sie diese Petrischale eine Stunde lang mit mäßiger Drehzahl (70 U/min) auf eine rotierende Plattform. Entfernen Sie 70 % Ethanol und ersetzen Sie es durch eine neue Charge mit 70 % Ethanol. Drehen und eine weitere Stunde waschen.
- Entsorgen Sie eine 70%ige Ethanol-Reinigungslösung. Steriles Wasser hinzufügen (gefiltert durch eine 0,2 μm Filtereinheit). Spülen Sie die Deckgläser gründlich aus, indem Sie die Petrischale mit der Hand drehen. Dreimal spülen und jedes Mal durch frisches steriles Wasser ersetzen.
- Legen Sie die Petrischale mit Deckgläsern in eine sterile Zellkulturhaube mit laminarer Strömung. Saugen Sie das Spülwasser durch die Vakuumleitung an und fügen Sie 10 ml gefiltertes steriles Wasser hinzu, um die Deckgläser einzutauchen. Die Deckgläser sollten steril sein und die Oberfläche sollte sauber genug für eine Poly-D-Lysin-Beschichtung sein.
- Öffnen Sie zwei 24-Well-Platten aus ihrer Einzelverpackung und legen Sie sie in die Haube.
- Schalten Sie die Vakuumleitung in der Haube ein. Schließen Sie eine 200-μl-Pipettenspitze an die Vakuumleitung an und schneiden Sie die Spitze mit einer Schere so ab, dass eine größere Öffnung entsteht.
- Verwende eine Pinzette #5 mit feiner Spitze, um Deckgläser nacheinander aus der Petrischale zu nehmen, und benutze die Vakuumleitung, um das Deckglas vollständig zu trocknen. Legen Sie dann jeweils ein Deckglas in die Vertiefungen der 24-Well-Platte. Die 50 gereinigten Deckgläser sollten ausreichen, um jede Vertiefung der beiden 24-Well-Platten zu füllen.
- Die Poly-D-Lysin-Stammlösung (1 mg/ml) wird mit einem Boratpuffer (pH 8,5) zu einer Arbeitslösung (0,1 mg/ml) verdünnt. Bereiten Sie für die vier 24-Well-Platten (einschließlich zweier Platten mit hoher Dichte und geätztem Boden) 30 ml Gesamtarbeitslösung vor.
- 300 μl 0,1 mg/ml Poly-D-Lysin-Arbeitslösung mit Glasdeckgläsern in jede Vertiefung geben. Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser vollständig in Lösung eingetaucht sind. Wenn nicht, verwenden Sie die Pinzettenspitze #5, um Deckgläser gegen den Boden der Vertiefung zu drücken, und verwenden Sie die Spitze, um die Poly-D-Lysin-Lösung zu führen, um die gesamte Oberfläche der Deckgläser zu bedecken. Überprüfen Sie alle Deckgläser visuell, um sicherzustellen, dass keine Luft zwischen der Platte und den Deckgläsern eingeschlossen ist.
- 300 μl 0,1 mg/ml Poly-D-Lysin-Arbeitslösung in jede Vertiefung der Kulturplatte mit hoher Dichte und geätztem Boden geben. Drehen Sie mit der Hand, um die Lösung so zu verteilen, dass der gesamte Boden der Vertiefung bedeckt ist.
- Setzen Sie alle vier Platten mit Poly-D-Lysin wieder in den Kulturinkubator ein und inkubieren Sie O/N.
>3. Waschen und Vorkonditionieren von Platten für die Kultur
HINWEIS: Die folgenden Schritte (3-5) werden am Tag der Gewebeentnahme durchgeführt.
- Nach der Inkubation/Beschichtung von Deckgläsern und 24-Well-Platten O/N werden alle vier Platten (zwei mit Spenderdeckgläsern, zwei Akzeptorplatten mit hoher Dichte und geätztem Kunststoffboden) in die Kulturhaube gebracht. Verwenden Sie die Vakuumleitung, um die Poly-D-Lysin-Lösung zu entfernen.
- Unmittelbar nach der Entfernung der Poly-D-Lysin-Lösung ~1 ml steriles Wasser mit einer Kunststoff-Transferpipette in jede Vertiefung geben. Nachdem alle Brunnen mit Wasser gefüllt sind, 10 min ziehen lassen. Entfernen Sie das Wasser durch Vakuum und fügen Sie dann 300 μl Waschmedium in jede Vertiefung hinzu, um den Boden der Vertiefung abzudecken (mit oder ohne Glasabdeckgläser). Lassen Sie die Poly-D-Lysin-Beschichtung nicht austrocknen.
- Setzen Sie alle vier Platten wieder in den Zellinkubator ein. Die Platten sind gebrauchsfertig, sobald die dispergierten Hippocampus-Neuronen vorbereitet sind.
>4. Plattierung von Neuronen und langfristige Co-Kultur
- Bringen Sie die beiden 24-Well-Platten mit geätzten Böden für Neuronen mit hoher Dichte in die Zellkulturhaube. Entfernen Sie das 300 μl Vorkonditionierungsmedium durch Vakuum. Platte 0,6 ml Zellsuspensionen hoher Dichte bei 250.000 Neuronen/ml.
- Die anderen beiden 24-Well-Platten mit Deckgläsern werden in die Kulturhaube eingebracht und das 300 μl Vorkonditionierungsmedium durch Vakuum entnommen. Platte 0,6 ml Zellsuspensionen niedriger Dichte mit 10.000 Neuronen/ml auf den Deckgläsern in den beiden 24-Well-Platten.
- Setzen Sie alle vier 24-Well-Platten wieder in den Inkubator ein. 2 Stunden ruhen lassen.
- Drehen Sie die Deckgläser mit niedriger Dichte mit anhaftenden Neuronen in die Kultur mit hoher Dichte um. Stellen Sie sicher, dass die Neuronen einander zugewandt sind (d. h. nicht durch das Glasdeckglas getrennt sind). Dann stellen Sie die beiden Platten mit Co-Kultur wieder in den Inkubator ein.
>5. Aufrechterhaltung der Co-Kultur
- Co-Kulturen durch Zugabe von 300 μl frischem Futtermedium (siehe Materialien) am Tag in vitro (DIV) 5 füttern. Es ist nicht erforderlich, 50 % des ursprünglichen vollständigen Nährmediums zu entfernen, wie in vielen anderen Studien berichtet wurde. Das Fütterungsmedium enthält außerdem 15 μM Cytosin-Arabinosid (Ara-C, um eine Endkonzentration von 5 μM zu erreichen), um die Wahrscheinlichkeit einer Gliakontamination und -proliferation zu minimieren.
- Nach dieser Erstfütterung geben Sie jede Woche 300 μl frisches Futtermedium ohne Ara-C in die Vertiefung. Sollte die Kultur länger als einen Monat aufbewahrt werden, ersetzen Sie die Hälfte des Mediums jede Woche über einen Monat hinaus durch frisches Futtermedium (wobei das Medium zur ersten Hälfte bei DIV33 ausgetauscht wird). Morphologisch gesehen sehen sowohl Neuronen mit hoher als auch mit niedriger Dichte bis zu drei Monate gesund aus (die längste Zeit, die von den Experimentatoren beobachtet wurde).