>1. Allgemeine Überlegungen
- In der Tabelle der Materialien/Ausrüstung finden Sie eine Liste der erforderlichen Reagenzien. Führen Sie alle Schritte unter strengen aseptischen Bedingungen durch.
- Verwenden Sie hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (hiFBS) für alle Medienpräparate, die FBS enthalten. Zur Hitzeinaktivierung wird ein 50 ml aliquotes FBS 30 min lang bei 56 °C erwärmt und alle 10 min invertiert (siehe auch Tabelle 1).
Anmerkung: Wenn FBS ohne Hitzeinaktivierung verwendet wird, schreitet der epithelähnliche Phänotyp in Kulturen von SH-SY5Y-Zellen schneller voran.
- Lassen Sie das Medium vor der Verwendung in einem Inkubator erwärmen und ausgleichen, um vor jedem Schritt ein korrektes pH-Gleichgewicht herzustellen. Zum Beispiel dauert es etwa eine Stunde, bis 50 ml Medium vollständig ausgeglichen sind (pH 7, 37 °C, 5 % CO2).
Anmerkung: Dieses Protokoll verwendet ein zweistufiges Teilungsverfahren, bei dem teilweise differenzierte SH-SY5Y-Zellen trypsinisiert und neu plattiert werden müssen. Dies ist ein stressiger Prozess für diese außergewöhnlich fragilen Zellen. Daher ist es wichtig, die Zellen für eine minimale Zeit in Trypsin zu inkubieren. Dies ermöglicht das bevorzugte Abheben von Neuronen, so dass epithelähnliche Zellen immer noch an der Schale haften.
- Führen Sie die Verreibung der differenzierten Zellen langsam mit einer 10-ml-Kunststoffpipette durch, wobei die Spitze gegen den Boden des konischen Röhrchens mit den Zellen stößt. Führen Sie die Verreibung mit langsamer Geschwindigkeit durch, nicht mehr als fünfmal auf und ab.
>2. Auftauen und Kultivieren von undifferenzierten SH-SY5Y-Neuroblastomzellen
- Bereiten Sie grundlegende Wachstumsmedien vor.
- Tauen Sie gefrorene Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell auf (ca. 2 min).
- Resuspendieren Sie die Zellen in 9 ml basischen Wachstumsmedien in einem konischen 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie dann 2 Minuten lang bei 1.000 x g.
- Aspirieren Sie den Überstand, achten Sie darauf, die pelletierten Zellen nicht zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 10 ml basischem Wachstumsmedium.
- Plättieren Sie die Zellen auf einen T-25-Kolben oder eine 60-mm-2-Schüssel.
- Tauschen Sie am nächsten Tag das Medium aus, um abgestorbene Zellen zu entfernen.
>3. Tag 0: Plattierung von Zellen zur Differenzierung
- In Abbildung 1 finden Sie den Differenzierungsplan.
- Undifferenzierte Zellen mit 1x PBS spülen, aspirieren und dann mit 1-2 ml erwärmtem 1x 0,05% Trypsin-EDTA trypsinisieren.
- Wenn sich die Zellen in Trypsin befinden, inkubieren Sie ca. 3 Minuten in einem Inkubator.
- Schrecken Sie das Trypsin ab, indem Sie 10 ml Basic Growth Media hinzufügen, spülen Sie die Seiten des Kolbens oder der Schale aus und reiben Sie es 1-3 Mal vorsichtig ab. Den Inhalt in ein konisches 15-ml-Röhrchen umfüllen.
- Zentrifugieren Sie 2 min lang bei 1.000 x g und saugen Sie das Medium an, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören.
- Pellet in 5 ml Basic Growth Media resuspendieren und 1-3 mal verreiben.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und verdünnen Sie sie dann mit basischen Wachstumsmedien auf 50.000 Zellen/ml.
- 2 ml Zellen pro 35 mm2 Schale für insgesamt 100.000 Zellen pro Schale auf die Platte geben und wieder in den Inkubator geben.
>4. Tag 1: Medien wechseln (Differenzierungsmedien #1)
- Aliquotieren Sie 50 ml des Differenzierungsmediums #1 (siehe Tabelle 2) und inkubieren Sie es in einem 37 °C warmen Wasserbad.
- Wenn das Medium erwärmt ist, lassen Sie es mindestens eine Stunde lang in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO2) äquilibrieren, um vor der Verwendung ein angemessenes pH-Gleichgewicht herzustellen.
- Retinsäure (RA) (siehe Tabelle 1) unmittelbar vor der Zugabe von Medien zu den Gerichten in erwärmte und äquilibrierte Medien geben.
Anmerkung: Retinsäure ist lichtempfindlich und sollte in dunklen Flaschen bei 4 °C gelagert werden
- Saugen Sie alte Medien vorsichtig ab und entsorgen Sie sie.
- 2 ml Differenzierungsmedium #1 mit RA pro 35 mm2 Schale zugeben und zurück in den Inkubator geben.
>5. Tag 3: Medien wechseln (Differenzierungsmedien #1)
- Wiederholen Sie Abschnitt 4 (Schritte 1-5)
>6. Tag 5: Medien wechseln (Differenzierungsmedien #1)
- Wiederholen Sie Abschnitt 4 (Schritte 1-5)
>7. Tag 7: Zellen 1:1 teilen
- Geben Sie RA zu erwärmten und äquilibrierten Differenzierungsmedien #1 unmittelbar vor der Zugabe von Medien zu Gerichten.
- Saugen Sie alte Medien vorsichtig ab und entsorgen Sie sie.
- 200 μl erwärmt 0,05% 1x Trypsin EDTA pro 35 mm2 Schale zugeben und in einem Inkubator ca. 2-3 min erwärmen oder bis die Zellen sichtbar von der Platte abgehoben sind, wie unter einem Mikroskop beobachtet.
- Quenden Sie das Trypsin ab, indem Sie 2 ml Differenzierungsmedium #1 mit RA pro 35 mm2 Schale hinzufügen und verwenden Sie das Medium, um die restlichen neuronalen Zellen von der Platte zu spülen. Anschließend den Inhalt in ein konisches 50-ml-Röhrchen umfüllen.
Anmerkung: Trypsinisieren Sie während der Trypsinisierungsschritte nicht zu viele Gerichte auf einmal. Dies trägt dazu bei, dass neuronale Kulturen nicht zu lange in Trypsin inkubiert werden, das zytotoxisch sein kann.
- Mischen Sie den Inhalt von bis zu 10 Schalen in der konischen 50-ml-Tube und reiben Sie ihn mit einer 10-ml-Kunststoffpipette langsam auf und ab, nicht mehr als fünfmal.
- Aliquotieren Sie 2 ml Zellsuspension in frische 35 mm2 Schalen und geben Sie sie zurück in den Inkubator.
>8. Tag 8: Medien wechseln (Differenzierungsmedien #2)
- Geben Sie RA (siehe Tabelle 1) unmittelbar vor der Zugabe von Medien zu Schalen zu erwärmten und äquilibrierten Medien.
- Saugen Sie alte Medien vorsichtig ab und entsorgen Sie sie.
- Geben Sie langsam 2 mL Differentiation Media #2 (siehe Tabelle 2) mit RA pro 35 mm2 Schale hinzu und kehren Sie in den Inkubator zurück. Lassen Sie Neuronen nicht über einen längeren Zeitraum der Luft aussetzen, da sie schnell austrocknen können.
>9. Tag 9: Gerichte mit extrazellulärer Matrix (ECM) zubereiten
- Tauen Sie eine Durchstechflasche mit ECM-Lösung auf Eis auf und verdünnen Sie sie 1:100 in kaltes DMEM.
- Geben Sie 2 ml der Mischung in jede 35 mm2 Schale und stellen Sie sicher, dass der gesamte Boden der Schale bedeckt ist.
- In einem Inkubator (37 °C, 5 % CO2) für 1 Stunde oder über Nacht aufbewahren.
- Das Gemisch ansaugen und ca. 1 Std. in einer Dunstabzugshaube an der Luft trocknen lassen. Bei Raumtemperatur bis zu 2 Monate lagern.
10. Tag 10: Zellen 1:1 auf ECM-beschichtete Platten übertragen
- Geben Sie RA (siehe Tabelle 1) unmittelbar vor der Zugabe von Medien zu Schalen zu erwärmten und äquilibrierten Medien.
- Saugen Sie das Medium vorsichtig ab und entsorgen Sie es.
- 200 μl erwärmtes Trypsin in jede 35 mm2 Schale geben und bei Raumtemperatur ca. 1-2 min inkubieren lassen oder bis die Neuronen sichtbar aus der Schale gehoben werden, wie unter dem Mikroskop beobachtet.
Anmerkung: Führen Sie diesen Trypsinisierungsschritt bei Raumtemperatur aus, um zu vermeiden, dass Neuronen zu stark mit Trypsin inkubiert werden und Schäden verursachen. Neuronen werden in diesem Stadium viel schneller aus den Platten freigesetzt als epithelähnliche Zellen.
- Löschen Sie das Trypsin, indem Sie 2 ml Differenzierungsmedium #2 pro 35 mm2 Schale hinzufügen und verwenden Sie das Medium, um die verbleibenden neuronalen Zellen von der Platte zu spülen. Füllen Sie den Inhalt dann in ein konisches 50-ml-Röhrchen um.
- Mischen Sie den Inhalt von bis zu 10 Schalen in der konischen 50-ml-Tube und reiben Sie ihn mit einer 10-ml-Kunststoffpipette langsam auf und ab, nicht mehr als fünfmal.
- 2 ml Zellsuspension in ECM-beschichtete 35 mm2 Schalen geben und zurück in den Inkubator geben.
11. Tag 11: Medien wechseln (Differenzierungsmedien #3)
- Geben Sie RA (siehe Tabelle 1) unmittelbar vor der Zugabe von Medien zu Schalen zu erwärmten und äquilibrierten Medien.
- Saugen Sie alte Medien vorsichtig ab und entsorgen Sie sie.
- Langsam 2 ml Differenzierungsmedium #3 (siehe Tabelle 2) mit RA pro 35 mm2 Schale zugeben und zurück in den Inkubator geben. Lassen Sie Neuronen nicht über einen längeren Zeitraum der Luft aussetzen.
>12. Tag 14: Medien wechseln (Differenzierungsmedien #3)
- Wiederholen Sie Abschnitt 11 (Schritte 1-3)
13. Tag 17: Letzter Medienwechsel (Differenzierungsmedien #3)
- Wiederholen Sie Abschnitt 11 (Schritte 1-3)
14. Tag 18: Neuronale Kulturen bereit zum Einsatz
- Wechseln Sie alle 3 Tage das Medium zu frischem Differenzierungsmedium #3 mit RA, um die Gesundheit der Neuronen zu erhalten.
Anmerkung: Zellen sollten in Neuronen differenziert sein und einen neuronalen Phänotyp aufweisen. Die Kulturen sind in der Regel bis zu 14 Tage nach der terminalen Differenzierung stabil. Die Dauer der Lebensfähigkeit der Neuronen hängt jedoch von der Passagenzahl der undifferenzierten Zellen zu Beginn der Differenzierung ab. Höhere Passagenzahlen führen zu differenzierten Neuronen mit kürzerer Lebensdauer.
Tabelle 1: Stammlösungen und Komponenten.
| Bestandteil | Details | Lager | Anweisungen |
| 10 μM RA | All-trans-Retinsäure | 5 mM | Resuspendieren Sie 50 mg RA in 33,3 ml 95% EtOH. RA reagiert empfindlich auf Hitze, Licht und Luft. In einer dunklen Flasche aufbewahren und bis zu 6 Wochen bei 4 °C lagern. Bei einer Verdünnung von 1:500 verwenden und unmittelbar vor der Verwendung in Differenzierungsmedien verdünnen |
| (300,44 g/mol) |
| 1x B-27 | B-27 Zuschlag | 50-fach | 1-10 ml Flasche auftauen und den restlichen Rest in 1 ml Einweg-Aliquoten auftauen und bei -80 °C lagern. 10 ml Flaschen bei -20 °C lagern |
| 20 mM KCl | Kaliumchlorid | 1 M | Geben Sie 250 ml Wasser auf 18,6 g KCl und sterilen Filter. Bei Raumtemperatur lagern |
| (74,55 g/mol) |
| 2 mM db-cAMP | Dibutyryl zyklisch AMP | 1 M | Resuspendieren Sie die volle Flasche, indem Sie 2,04 ml Wasser zu 1 g db-cAMP hinzufügen. Empfindlich gegen Licht und Feuchtigkeit. In Aliquoten von 100 μl oder 200 μl bei -20 °C oder -80 °C lagern |
| (491,37 g/mol) |
| 50 ng/ml BDNF | Vom Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor (BDNF) | - | Zentrifugieren Sie das Fläschchen, um das Pulver auf den Boden zu bekommen. Resuspendieren Sie 10 μg Fläschchen in 1 ml Neurobasal + 1x B27 oder 5 μg Fläschchen in 0,5 ml Neurobasal + 1x B27, um 10 μg/ml zu erhalten. Bei einer Verdünnung von 1:200 verwenden. Arbeitsaliquoten bei -80 °C lagern (z. B. 250 μl) |
| hiFBS | Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum | - | Aliquot taute FBS in konische 50-ml-Röhrchen auf. Bei 56 °C im Wasserbad 30 Min. erhitzen. Entnahme und Einfrieren der Arbeitsaliquote bei -20 °C |
Tabelle 2: Medienrezepte.
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| Grundlegende Wachstumsmedien |
| Bestandteil | Volumen für 500 ml | Verdünnung |
| EMEM | 415 ml EMEM | |
| 15 % hiFBS | 75 ml hiFBS | |
| 1x Stift/Streptokokken | 5 ml Stift/Streptokokken | 1:100 |
| 2 mM Glutamin | 5 ml Glutamin | 1:100 |
| *Maximal 6 Wochen aufbewahren | |
| Differenzierungsmedien #1 |
| Bestandteil | Volumen für 50 ml | Verdünnung |
| EMEM | 48 ml EMEM | |
| 2,5 % hiFBS | 1,3 ml hiFBS | |
| 1x Stift/Streptokokken | 500 μl Stift/Streptokokken | 1:100 |
| 2 mM Glutamin | 500 μl Glutamin | 1:100 |
| 10 μM RA | 100 μl RA (5 mM Lagerbestand) | 1:500 |
| *Maximal 2 Wochen aufbewahren und unmittelbar vor der Anwendung RA hinzufügen |
| *Behalten Sie keine zusätzlichen Medien, sobald RA hinzugefügt wurde - RA ist instabil |
| Differenzierungsmedien #2 |
| Bestandteil | Volumen für 50 ml | Verdünnung |
| EMEM | 49 ml EMEM | |
| 1 % hiFBS | 500 μl hiFBS | |
| 1x Stift/Streptokokken | 500 μl Stift/Streptokokken | 1:100 |
| 2 mM Glutamin | 500 μl Glutamin | 1:100 |
| 10 μM RA | 100 μl RA (5 mM Lagerbestand) | 1:500 |
| *Maximal 2 Wochen aufbewahren und unmittelbar vor der Anwendung RA hinzufügen |
| *Behalten Sie keine zusätzlichen Medien, sobald RA hinzugefügt wurde - RA ist instabil |
| Differenzierungsmedien #3 |
| Bestandteil | Volumen für 50 ml | Verdünnung |
| Neurobasal | 47 ml Neurobasal | |
| 1x B-27 | 1 ml B-27 (50x Lagerbestand) | 1:50 |
| 20 mM KCl | 1 ml KCl (1M Lagerbestand) | 1:50 |
| 1x Stift/Streptokokken | 500 μl Stift/Streptokokken | 1:100 |
| 2 mM GlutamaxI | 500 μl GlutamaxI (100x Lager) | 1:100 |
| 50 ng/ml BDNF | 250 μl BDNF-Stamm (10 μg/ml) | 1:200 |
| 2 mM Dibutyryl zyklischer AMP (db-cAMP) | 100 μl db-cAMP (1M Lager) | 1:500 |
| 10 μM RA | 100 μl RA (5 mM Vorrat) | 1:500 |
| *Maximal 2 Wochen aufbewahren und unmittelbar vor der Anwendung RA hinzufügen |
| *Behalten Sie keine zusätzlichen Medien, sobald RA hinzugefügt wurde - RA ist instabil |
