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>1. Embryonale Stammzellkultur der Maus
- Bereiten Sie mit 0,1 % Gelatine beschichtete Zellkulturschalen oder -platten vor.
- Geben Sie 2 ml sterilisierte 0,1 % Gelatine (0,1 % w/v in Wasser) in 60-mm-Zellkulturschalen. Sanftes Schaukeln, um eine gleichmäßige Beschichtung der Zellkulturschalen zu gewährleisten.
- Die Schalen in einen 5%igen CO2 -Inkubator bei 37 °C stellen und 1 h ziehen lassen.
- Entfernen Sie die 0,1%ige Gelatinelösung, bevor Sie die Zellen aussäen.
Anmerkung: Nach dem Entfernen der Gelatine entfällt das Trocknen oder Waschen des beschichteten Geschirrs.
- Kultur embryonaler Stammzellen der Maus (A2lox und 129)
- Inkubieren Sie mES-Zellen (A2lox und 129) in den mit 0,1 % gelatinebeschichteten 60-mm-Zellkulturschalen in mESC-Wachstumsmedium bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator. Das mESC-Wachstumsmedium besteht zu 85 % aus Knock-out-Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium/Nährstoff-Gemisch F-12 (DMEM/F12), 15 % Knock-out-Serumersatz (KSR), 0,1 mM β-Mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1 % nicht-essentieller Aminosäure (NEAA), 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S), 1000 U/mL Leukämie-Hemmfaktor (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3-Inhibitor) und 0,33 nM PD0325901 (MEK-Inhibitor).
ACHTUNG: β-Mercaptoethanol ist brennbar und hat eine Inhalationstoxizität. Halten Sie sich von Brandherden fern und tragen Sie eine Maske, um ein Einatmen während des Gebrauchs zu vermeiden.
- Wechseln Sie täglich das mESC-Wachstumsmedium, um ein besseres Wachstum von A2lox und 129 zu erzielen.
- Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen, entfernen Sie das Medium und geben Sie 1 ml 0,1 % Trypsin in die Schale. 30 s lang sanft schaukeln, um eine gleichmäßige Abdeckung aller Zellen mit Trypsin zu gewährleisten.
- Lassen Sie die Zellen etwa 1 Minute lang trypsinisieren und entfernen Sie dann das Trypsin mit einer 1-ml-Pipette.
- Geben Sie 2 ml mESC-Wachstumsmedium in die Schale, pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
- Zählen Sie die Dichte der Zellen in der Suspension so genau wie möglich mit einem Hämozytometer.
- Teilen Sie die Zellen in 7 Gruppen auf und induzieren Sie die Differenzierung mit verschiedenen Protokollen, die in Tabelle 1 gezeigt sind.
>2. Unterscheidung von mESCs zu NPCs
- Bereiten Sie mit 0,1 % Gelatine beschichtete Zellkulturplatten oder Deckgläser vor.
- Bereiten Sie vor der Verwendung 0,1 % gelatinebeschichtete 6-Well-Platten oder Deckgläser wie in Schritt 1.1 vor.
- Differenzierung (Tabelle 1)
- 1,5 x 106 mES-Zellen werden in eine nicht adhäsive Bakterienschale in 10 ml basalem Differenzierungsmedium I gegeben, um die Bildung des Embryoidkörpers bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator zu ermöglichen.
- Nach 2 Tagen werden die Zellaggregate in 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und durch die Schwerkraft abgesetzt
.
- Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml frisches basales Differenzierungsmedium I hinzu, um die Embryoidkörper zu resuspendieren. Pflanzen Sie sie in eine neue, nicht klebende Bakterienschale um und lassen Sie sie weitere 2 Tage lang differenzieren.
- Überprüfen Sie die Bildung von Embryoidkörpern unter dem Mikroskop (Abbildung 1A).
- Entnahme von Embryoidkörpern wie in den Schritten 2.2.2 bis 2.2.3 beschrieben. Säen Sie etwa 50 Embryoidkörper in 2 ml basalem Differenzierungsmedium I pro Vertiefung auf 0,1 % gelatinebeschichtete 6-Well-Platten.
- Bereiten Sie 1 mM All-trans-Retinsäure (RA)-Brühe (in DMSO) vor und lagern Sie sie nach dem Umpacken lichtgeschützt in einem Gefrierschrank bei -80 °C.
Anmerkung: RA ist instabil, und es sollte darauf geachtet werden, dass es während der Vorbereitung von RA-Material von Licht ferngehalten und der Luftkontakt reduziert wird.
- Für die RA-Induktion geben Sie 2 μl RA-Stamm in jede Vertiefung, um eine Endkonzentration von 1 μM zu erreichen.
- Die Platte bei 37 °C in den 5 %CO 2 -Inkubator stellen und weitere 4 Tage differenzieren.
- Wechseln Sie alle 2 Tage die gesamten 2 mL des basalen Differenzierungsmediums I (mit 1 μM RA).
Tabelle 1: Details des zur Unterscheidung verwendeten Protokolls.
| Protokoll | Medien |
| 4-tägige Bildung von Embryoidkörpern + 4-tägige RA-Induktion | Basales Differenzierungsmedium:
DMEM/F12 +15 % FBS + 1 % NEAA+0,1 mM 2ME + 1 % P/S |
