Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen in Neuronen

Zusammenfassung

Quelle: Mao, X., et al. Neuronale Differenzierung aus embryonalen Stammzellen der Maus In vitro. J. Vis. Exp. (2020).

Das Video zeigte eine Zellkulturmethode zur Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen in Neuronen. Durch die Inkubation von Zellen in einem nährstoffreichen Medium, das mit Wachstumsfaktoren ergänzt wurde, reiften die Vorläuferzellen zu Neuronen mit entwickelten Axonen und Dendriten. Ein Stabilisierungsmittel sicherte die Lebensfähigkeit der Zellen und schützte vor oxidativen Schäden während des gesamten Differenzierungsprozesses.

Protokoll

>1. Differenzierung von NPCs zu Neuronen (Phase II)

1. Säen Sie etwa 5 x 10⁵ embryonale Stammzellen der Maus oder mESC-Derivate innerhalb von 2 ml basalem Differenzierungsmedium I pro Vertiefung auf die mit 0,1 % gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Teilen Sie die mESC-Derivate nach dem Zufallsprinzip in 3 Gruppen auf, jeweils als Phase-II-Protokoll 1, Protokoll 2 und Protokoll 3.
2. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5 %_{CO 2} -Inkubator, damit sie 6 Stunden lang befestigt werden kann. Waschen Sie sie zweimal mit 2 mL PBS.
3. Geben Sie jeweils 2 ml basales Differenzierungsmedium I, N2B27 Medium I und N2B27 Medium II (Tabelle 1) zu jeder Vertiefung der oben genannten Gruppen.
4. Legen Sie die Platten in den Inkubator und lassen Sie sie weitere 10 Tage differenzieren. Wechseln Sie das entsprechende Medium alle 2 Tage.
5. Überprüfen Sie den Differenzierungsstatus und notieren Sie die morphologischen Veränderungen, wie in Schritt 3 erwähnt.
6. Bewerten Sie an Tag 18 die Generierung von Neuronen (β-Tubulin III positiv) und bestimmen Sie die Differenzierungseffizienz der 3 Protokolle, die in Schritt 4 verwendet wurden.

Ergebnisse

Tabelle 1: Details zu den 3 Protokollen, die in der Phase-II-Differenzierung verwendet wurden.

Differenzierung Phase II (10d)
	Protokolle	Medien
Protokoll Nr. 1	Differenzierung natürlich: Mit dem basalen Differenzierungsmedium I

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-β-Tubulin-III-Antikörper, der in Kaninchen hergestellt wird	Sigma Aldrich	T2200	Lagerung bei -80 °C, wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden
B-27 Supplement (50X), serumfrei	Gibco	17504044	bei -20 °C gelagert und vor Licht geschützt
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023,01 Mrd.	gelagert bei 4 °C
Fötales Rinderserum	HyClone	SH30084.03	bei -20 °C lagern, wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden
Fluoreszenzmikroskopie	Olymp	CKX53
Gelatine	Gibco	CM0635B	Bei Raumtemperatur gelagert
GlutaMAX Ergänzung	Gibco	35050061	gelagert bei 4 °C
Immunol-Färbung Primärer Antikörper-Verdünnungspuffer	Beyotime	Nr. P0103	gelagert bei 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	gelagert bei 4 °C
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren	Gibco	11140076	gelagert bei 4 °C
N-2 Ergänzung (100X)	Gibco	17502048	bei -20 °C gelagert und vor Licht geschützt
Normales Ziegenserum	Jackson	Tel.: 005-000-121	gelagert bei -20 °C
Neurobasales Medium	Gibco	21103049	gelagert bei 4 °C
Nicht klebende Bakterienschale	Corning	3262
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1X)	HyClone	SH30256,01 Mrd.	gelagert bei 4 °C
Penicillin/Streptomycin-Lösung	HyClone	SV30010	gelagert bei 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	Nr. S1036	gelagert bei -20 °C
Retinsäure	Sigma	Nr. R2625	bei -80 °C gelagert und vor Licht geschützt
Stamm 129 Embryonale Stammzellen der Maus	Cyagen	MUAES-01001	Wartung in einem feederfreien Kultursystem
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	bei 4 °C gelagert und vor Licht geschützt
4% Paraformaldehyd	Beyotime	Nr. P0098	gelagert bei -20 °C
6 - Well Platte	Corning	3516
60 mm Zellkulturschale	Corning	430166
15 ml Zentrifugenröhrchen	Nunc	Artikel-Nr.: 339650

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