Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Dissoziation sensorischer Ganglien
- Pipettieren Sie 500 μl Gangliendissoziationslösung (GaDS) aus (Tabelle 1) und lassen Sie die Ganglien im Röhrchen. Waschen Sie die Ganglien einmal, indem Sie 1 ml Phosphatpufferlösung (PBS) hinzufügen, warten Sie, bis sich die Ganglien am Boden des Röhrchens abgesetzt haben, und pipettieren Sie dann PBS heraus.
- 1 ml GaDS und 22 μl Verdauungsenzym (Kollagenase I/II und Protease-Mix, 2,5 mg/ml in Wasser) werden in jedes Röhrchen gegeben.
- Geben Sie 20 μl Fast Blue (5,26 mM) in das Positivkontrollröhrchen.
- Legen Sie die Schläuche in ein Wasserbad oder einen Heizblock, der auf 37 °C eingestellt ist.
- Schütteln Sie die Schläuche alle 15 Minuten kurz und schnippen Sie sie, um sicherzustellen, dass die Ganglien mit der Lösung bedeckt sind.
Anmerkung: Der Zeitpunkt der Ganglienverdauung hängt vom Alter des Verdauungsenzyms ab. Innerhalb eines Monats nach dem Auflösen des Verdauungsenzyms 30 Minuten lang verdauen; Innerhalb von 2 - 6 Monaten 45 Minuten verdauen. Wenn das Enzym älter als sechs Monate ist, verdauen Sie die Ganglien 60 Minuten lang.
- Während der Verdauung der Ganglien sind Dichtegradienten mit einer Partikellösung (kolloidale Kieselsäurepartikel, die mit Polyvinylpyrrolidon beschichtet sind) herzustellen.
- Mischen Sie 12%ige Partikellösung in GaDS, 500 μl pro Probe.
- Mischen Sie 28%ige Partikellösung in GaDS, 500 μl pro Probe.
- Geben Sie langsam und vorsichtig 400 μl Lösung mit 12 % Dichte auf 400 μl Lösung mit 28 % Dichte in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen für jede Probe. Lassen Sie die beiden Schichten nicht vermischen. In der Tube sollten zwei unterschiedliche Schichten sichtbar sein, von denen eine dunkler ist als die andere.
- Nach der entsprechenden Verdauungszeit wird GaDS mit Verdauungsenzym entfernt und die Ganglien zweimal mit 1 ml PBS gewaschen. Geben Sie 200 μl frisches GaDS in jedes Röhrchen.
- Verwenden Sie eine 200-μl-Pipette mit einem Volumen von 100 μl und pipettieren Sie die Ganglien mehrmals auf und ab, um die Zellen auseinander zu brechen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis kein intaktes Gewebestück mehr zu sehen ist. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen in der Lösung.
- Dissoziierte Zellen werden durch ein 70 μm Zellsieb geleitet.
- Geben Sie weitere 100 μl GaDS in das ursprüngliche Dissoziationsröhrchen, um alle verbleibenden Streuzellen aufzunehmen und die zusätzliche Lösung durch das Zellsieb zu leiten. Fangen Sie mit einer neuen Pipettenspitze die restliche zellhaltige Flüssigkeit auf, die durch das Sieb gelaufen ist und am Netz haftet. Das endgültige Volumen der in GaDS suspendierten Zellen beträgt 300 μl.
- Schichten Sie die 300 μl Zellen vorsichtig auf den zuvor erstellten Dichtegradienten. Vermeiden Sie Blasen und Vermischung der Zellen mit den Dichteschichten.
- 10 min bei 2.900 x g bei RT zentrifugieren.
- Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen und entsorgen Sie die oberste 700-μl-Schicht. Diese Schicht enthält den Großteil der Zelltrümmer, die sonst die Zellsortierung beeinträchtigen würden.
- Geben Sie 700 μl frisches GaDS in die verbleibende zellhaltige Lösung und pipettieren Sie zum Mischen mehrmals auf und ab.
- 18. 15 min bei 2.900 x g zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren.
- 19. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen und entsorgen Sie den Überstand, wobei das Küvettenpellet übrig bleibt.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 - 300 μl GaDS, indem Sie mit einer auf 200 μl eingestellten 1.000 μl Pipette mehrmals auf und ab pipettieren. Legen Sie die Proben auf Eis.
Tabelle 1. Reagenzmischung für Gangliendissoziationslösung (GaDS).
| Bestandteil | Menge |
| Erweitertes DMEM/f12 | 9,5 ml |
| Glutamin | 100 μl |
| HEPES (10 mM) | 100 μl |
| N2-Ergänzung | 100 μl |
| B27 (ohne Vitamin A) | 200 μl |
| NGF (50 μg/ml) | ca. 10 μl |
