Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt die Präparations- und Kulturmethode für die Langzeitinkubation und intermittierende Bildgebung von Hippocampus-Schnitten. Eine einzelne Hippocampusscheibe wird mit einem Plasmagerinnsel auf ein speziell präpariertes photogeätztes Deckglas aufgebracht, und dann werden die Deckgläser auf der flachen Seite eines ausgebohrten Rollenrohrs versiegelt, das in einem Rolleninkubator aufbewahrt wird.
>1. Vorbereitung des Rollenrohr-Racks
- Verwenden Sie die in Abbildung 1A gezeigte Vorlage, die in der auf der Maßstabsleiste gezeigten Größe gedruckt wird. Stanzen Sie mit einem Nagel kleine Löcher (groß genug für einen feinen Punktmarkierer) in die Schablone, die mittig auf den Löchern liegen.
- Legen Sie die Schablone auf den Boden einer 15 cm großen Gewebekulturschale (Nenndurchmesser 14 cm) und markieren Sie die Position der Löcher. Wiederholen Sie dies bei einem zweiten Gericht.
- Bohren Sie mit Bohrern, die für die Verwendung auf Kunststoff ausgelegt sind, sechs Löcher mit einem Durchmesser von 1,5 cm in einer sechseckigen Anordnung (4,8 cm von Mitte zu Mitte) mit einem Lochabstand von 2,5 cm vom Rand der Schale. Bohren Sie drei Löcher (3 mm Durchmesser) 12 mm von der Kante entfernt, die in gleichem Abstand zwischen zwei der größeren Löcher platziert sind, wie in Abbildung 1A gezeigt.
- Platzieren Sie mit den Böden jeder Schale zueinander eine 2,5 Zoll lange Maschinenschraube (3/16 Zoll Durchmesser) mit einer Unterlegscheibe durch eines der kleinen Löcher, gefolgt von einer zweiten Unterlegscheibe, einem Stück Polyethylenschlauch (Abstandshalter, 4,7 cm), einer weiteren Unterlegscheibe, der zweiten Gewebekulturschale, einer weiteren Unterlegscheibe, einer Sicherungsscheibe, und eine Nuss.
- Wiederholen Sie Schritt 1.4 an den beiden anderen Maschinenschrauben und ziehen Sie sie nur locker an, bis alle Maschinenschrauben an Ort und Stelle sind. Ziehen Sie dann die Muttern fest an.
- Arbeiten Sie die Ösen (5/16 Zoll dick, 5/8 Zoll Lochdurchmesser) in die Löcher der unteren Schale ein, um das endgültige Rollenrohrgestell zu erhalten (Abbildung 1B; gezeigt mit zwei Rohren). Platzieren Sie auf jedem Gestell einen Aufkleber mit einer eindeutigen Nummer.
>2. Vorbereitung von Rollenrohren und Deckgläsern
- Herstellung der Vorrichtung zum Bohren des Lochs in Rollenrohre
- Bohren Sie ein 1,5 cm tiefes Loch 8 cm tief in die Mittelseite eines 2 x 4 x 5,5 Zoll großen Holzblocks in einem Winkel, so dass die flache Seite des Rollenrohrs beim Einsetzen nahezu parallel zum Block ist (Abbildung 2A).
- Vergrößern Sie das Loch mit einer runden Holzfeile, um das Loch sowohl zu verbreitern als auch zu verjüngen, um das Einführen des Schlauchs zu ermöglichen (Rollenrohre haben einen etwas größeren Durchmesser in der Nähe des Kappenendes) (Abbildung 2B).
- Bohren Sie ein vertikales Loch mit einem Durchmesser von 1,5 cm, 5,5 cm von der Seite des Blocks entfernt und zentriert über dem Seitenloch (Abbildung 2C).
- Wenn das Seitenloch konisch genug verjüngt ist, führen Sie ein Rollenrohr ein, das an der gewünschten Stelle markiert ist, um das Loch für die Scheibe zu zentrieren, und positionieren Sie das Rohr so, dass die markierte Stelle in dem 1,5 cm vertikalen Loch zentriert ist.
- Entfernen Sie das Rohr und messen Sie den Abstand vom Fleck bis zum Ende des Rohrs. Markieren Sie diesen Abstand von der Mitte des Lochs in der Vorrichtung und setzen Sie einen Nagel ein, um einen Anschlag zu schaffen, um das Rohr zum Bohren richtig zu positionieren (Pfeil in Abbildung 2C).
- Schneiden Sie den Nagel mit einer Bügelsäge bündig mit der Oberfläche des Holzblocks ab, um Verletzungen zu vermeiden.
- Fügen Sie Federklammern an der Unterseite der Vorrichtung hinzu, wenn es eine Bohrmaschine mit Schlitzen gibt, die die Verankerung ermöglichen (Abbildung 2D, schwarzer Pfeil). Andernfalls verwenden Sie C-Klemmen, um die Vorrichtung sicher auf der Bohrmaschine zu halten.
- Bohren Sie mit der oben beschriebenen Vorrichtung ein flaches 11 cm langes Kunststoffkulturröhrchen mit der flachen Seite nach oben (Abbildung 2A) und bohren Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 6 mm, dessen Mitte 1,0 cm von unten entfernt und zwischen den Seiten des Rohrs zentriert ist.
Anmerkung: Es sollte ein Bohrer verwendet werden, der für Kunststoff ausgelegt ist.
- Glätten Sie mit einem schwenkbaren Entgratwerkzeug die Kanten des Lochs (Abbildung 2E) und machen Sie 4 Rillen an der Innenkante des Lochs (Abbildung 2E, Einsatz), um das Entleeren des Lochs während der Drehung zu erleichtern.
- Schneiden Sie mit einem Locher mit 12 mm Durchmesser Scheiben mit einem Durchmesser von 12 mm aus ungiftigen doppelseitig klebenden Silikonkautschukplatten. Bohren Sie mit einer Standard-Papierstanze mit einem Loch (6 mm Durchmesser) ein Loch in die Mitte jeder Scheibe.
- Spülen Sie die gebohrten Röhrchen mit 70%igem Ethanol, trocknen Sie sie an der Luft in einer biologischen Sicherheitswerkbank und sterilisieren Sie die Röhrchen und die gestanzten Klebepunkte für 40 min unter der UV-Lampe (30 W bei 70 cm durchschnittlichem Abstand) in der biologischen Sicherheitswerkstatt.
- Positionieren Sie die Schläuche und Scheiben nach 20 Minuten neu, so dass alle freiliegenden Oberflächen sterilisiert sind. Ziehen Sie unter sterilen Bedingungen die weiße Unterlage von einer Klebescheibe ab und befestigen Sie den Silikonkautschuk an der Außenseite einer Tube, indem Sie die Löcher ausrichten (Abbildung 2F).
Vorsicht: Um UV-Strahlung zu vermeiden, tragen Sie einen Augenschutz und schließen Sie den Schrank, bevor Sie die UV-Lampe einschalten.
- Saubere, fotogeätzte (100 mittig nummerierte 1 mm Quadrate) deutsche Glasdeckgläser mit einem Durchmesser von 12 mm. Halten Sie die Deckgläser vorsichtig mit einer Pinzette fest und tauchen Sie absolutes Ethanol ein, gefolgt von Wasser, gefolgt von absolutem Ethanol, und tauchen Sie die Deckgläser schließlich in eine Flamme, um das Ethanol zu verbrennen. Lassen Sie die Deckgläser abkühlen.
- Halten Sie die Deckgläser mit einer Pinzette fest und tauchen Sie sie 10 s lang in 2%iges 3-Aminopropyltriethoxysilan in Aceton. Spülen Sie die Deckgläser mit Reinstwasser ab und lassen Sie sie an der Luft trocknen.
- Legen Sie die Deckgläser auf steriles Filterpapier in eine biologische Sicherheitswerkbank und schalten Sie das UV-Licht ein. Belichten Sie jede Seite der Deckgläser für 20 Min.
Vorsicht: Um UV-Strahlung zu vermeiden, tragen Sie einen Augenschutz und schließen Sie den Schrank, bevor Sie die UV-Lampe einschalten.
>3. Vorbereitung von Hippocampus-Schnitten
- Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, bereiten Sie Hälften von zweischneidigen Rasierklingen für den Gewebezerkleinerer vor. Falten Sie die Klingen vorsichtig mit den Fingern der Länge nach und schnappen Sie sie in zwei Hälften.
- Spülen Sie die Klingenhälften mit Aceton mit einem Wattestäbchen ab, um sie zu reinigen, und spülen Sie sie anschließend mit absolutem Ethanol ab und trocknen Sie sie an der Luft. Bevor Sie eine halbe Klinge an den Gewebezerkleinerer montieren, sterilisieren Sie sie, indem Sie sie mit 70 % Ethanol spülen.
- Befolgen Sie die Protokolle, die vom institutionellen Animal Care and Use Committee genehmigt wurden. Nach der Isofluran-Anästhesie wird ein 4-7 Tage alter Mäuse- oder Rattenwelpe durch Enthauptung eingeschläfert und der Kopf mit einer Schere oder Guillotine entfernt.
Anmerkung: Das Kulturprotokoll für Gehirnschnitte ist unabhängig vom Maus- oder Rattenstamm oder Genotyp. Es wurden viele transgene Mauslinien mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund verwendet.
- Spülen Sie den Kopf mit 70 % Ethanol ab und legen Sie ihn in eine 60 mm Petrischale. Bis zur endgültigen Montage der Hirnscheibe auf dem Rollenrohr werden alle folgenden Schritte in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt, um die Sterilität zu erhalten.
- Machen Sie mit einer chirurgischen Klinge #21 einen sagittalen Schnitt durch die Haut und den Schädel. Mit einer Dumont-Pinzette #5 schälen Sie die Haut und den Schädel zurück, um das Gehirn freizulegen.
- Mit geschlossener Pinzette das ganze Gehirn sanft herauskitzeln und durch Einklemmen mit der Pinzette durch den Hirnstamm hinter dem Kleinhirn lösen. Legen Sie das Gehirn in eine sterile 60-mm-Schale mit 4 °C Gey's Balanced Salt Solution/0,5 % Glukose (GBSS/Glukose).
- Mit einem Präpariermikroskop wird das Gehirn sichtbar gemacht (Abbildung 3A), die Rückenseite des Gehirns nach oben gelegt und das vordere Drittel des Gehirns und das Kleinhirn mit einer chirurgischen Klinge abgeschnitten (Abbildung 3B).
- Halten Sie das getrimmte Gehirn mit einer Pinzette mit der hinteren Seite nach oben und der ventralen Seite gegen die Seite der Petrischale, um die Stabilität zu gewährleisten. Ziehen Sie die Hirnhäute um die sagittale Mittellinie herum vorsichtig weg und entfernen Sie das Mittelhirngewebe mit einer feinen Dumont #5 Pinzette (Abbildung 3C, gestrichelter Kreis).
- Machen Sie zwei Schnitte entlang der Seite des Gehirns, um es zu spreizen (Abbildung 3C, gestrichelte Linien). Sobald das Gehirn mit der Rückenseite nach unten platziert und gespreizt wird, sollte die Hippocampus-Fissur sichtbar sein (Abbildung 3D, Pfeil).
- Übertragen Sie das gespreizte offene Gehirn auf ein Stück Polychlortrifluorethylen-Kunststofffolie und positionieren Sie es zum Schneiden auf der Bühne eines Gewebezerkleinerers. Befeuchten Sie die Klinge mit GBSS/Glukose und hacken Sie den Hippocampus in ~300 μm dicke Scheiben.
- Spülen Sie das geschnittene Gehirn mit einer Transferpipette von der Plastikfolie in eine frische 60-mm-Schale, die GBSS/Glukose enthält (Abbildung 3E). Kneifen Sie die restlichen Hirnhäute und anderes nicht-hippokampales Gewebe (Abbildung 3F) vorsichtig ab und ziehen Sie sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze von den Scheiben ab (Abbildung 3G, H).
>4. Plattieren von Scheiben
- Sobald die Scheiben erhalten wurden, geben Sie 2 μl Hühnerplasma auf die Mitte der fotogeätzten Seite eines vorbereiteten Deckglases. Verteilen Sie das Plasma leicht, um einen Fleck mit einem Durchmesser von 3-4 mm zu erhalten.
Anmerkung: Die fotogeätzte Seite ist die Oberseite des Deckglases, wenn sie durch ein Präpariermikroskop betrachtet wird, so dass die Zahlen richtig ausgerichtet sind.
- Übertragen Sie 1 Gehirnscheibe mit einem sterilen Spatel mit schmaler Spitze (Abbildung 4A) auf den Plasmaspot (Abbildung 4B). Verwenden Sie eine geschlossene Pinzette, um die Scheibe auf der Spatelspitze zu halten, während Sie die Scheibe aus dem GBSS/Glukose heben.
- Berühren Sie den Spatel mit dem Plasmafleck auf dem Deckglas und schieben Sie die Scheibe mit geschlossener Pinzette auf das Deckglas.
- Mischen Sie 2,5 μl Plasma mit 2,5 μl Thrombin in einem separaten Röhrchen. Geben Sie schnell 2,5 μl dieser Mischung über und um die Scheibe und pipetieren Sie sie vorsichtig auf und ab, um sie zu mischen (Abbildung 4B).
Anmerkung: Das Plasma gerinnt innerhalb von 10-15 s, daher muss dies schnell erfolgen. Wenn die Scheibenhaftung ein Problem darstellt, mischen Sie 5 μl Plasma mit 5 μl Thrombin und verwenden Sie 4-5 μl auf der Scheibe und entfernen Sie nach dem Mischen einen Teil, so dass die Scheibe flach auf dem Deckglas liegt.
- Entfernen Sie die durchsichtige Kunststoffabdeckung von der freiliegenden Seite des Silikonkautschukklebers, der zuvor auf einem Rollenrohr befestigt war, und legen Sie das Deckglas mit der Gehirnscheibe auf den Klebstoff, um die Scheibe innerhalb des Lochs auszurichten (Abbildung 4C).
- Um die Haftung zu gewährleisten, üben Sie mit dem Daumen einen sanften, gleichmäßigen Druck auf das Deckglas aus, indem Sie das Deckglas gleichmäßig nach unten drücken und ca. 1 min halten, während Sie es in die biologische Sicherheitswerkbank übergeben.
- Geben Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank 0,8 ml vollständiges Neurobasal-A-Kulturmedium (Materialtabelle) in jedes Röhrchen (Abbildung 4D).
- Lassen Sie ein Gemisch aus 5 % CO2/95 % Luft durch eine sterile Pasteur-Pipette mit Wattestopfen fließen, die sicher von einer Klemme gehalten wird. Spülen Sie das Rollenrohr mit dem Gasgemisch und verschließen Sie das Röhrchen schnell, während es um die Pipette herum herausgezogen wird.
- Beschriften Sie die Röhrchen mit der Scheibennummer und der Racknummer. Legen Sie die Rohre in ein Rollengestell und stellen Sie sicher, dass sie geometrisch ausbalanciert sind. Wenn es eine ungerade Anzahl von Röhren gibt, füge Röhren hinzu, um sie auszugleichen.
- Stellen Sie die Gestelle in einen 35 °C heißen Rolleninkubator, wobei die Rollen den Rollenrost mit etwa 10-13 Umdrehungen pro Stunde (RPH) drehen (Abbildung 4E). Um das Medium im Boden der Röhrchen zu halten, kippen Sie den Inkubator um ca. 5° nach hinten, indem Sie die Vorderseite auf einem Brett anheben.
