>1. Standardisierung neuronaler Kulturen mit mikrofluidischen Bauelementen: Gerätemontage
- Wählen Sie ein geeignetes mikrofluidisches Gerät für das gewünschte Experiment aus. Um Neuronen innerhalb derselben Population zu verbinden, verwenden Sie die Neuro Devices (Abbildung 1), und um Neuronen in verschiedenen Populationen zu verbinden, verwenden Sie die Co-Culture Devices (Abbildung 2).
- Reinigen und bereiten Sie die gewünschte Anzahl an sterilen Deckgläsern oder Glasbodenschalen vor. Für beste Ergebnisse auf Kunststoffoberflächen verwenden Sie 35-mm-Schalen, auf Glas 25-mm-Deckgläser oder 35-mm-Glasbodenschalen. Wählen Sie die Glasdicke basierend auf dem Bildgebungssystem, z. B. 0,15 mm.
- Beschichten Sie das Geschirr oder die Deckgläser mit 0,5-1 mL 100 μg/mL PDL für 2 h oder über Nacht bei Raumtemperatur.
Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert und auf Wunsch am nächsten Tag fortgesetzt werden. Darüber hinaus können Schalen mit Boratpuffer-verdünntem PDL, Poly-L-Lysin (PLL), Laminin oder einem anderen Zelladhäsionsmolekül beschichtet werden.
- Spülen Sie das Geschirr zweimal mit Wasser (verwenden Sie keine phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), da Salzkristalle die Kanäle verstopfen können), entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und lassen Sie sie in einer sterilen Umgebung, z. B. in einer Biosicherheitswerkstätte, 5-10 Minuten trocknen oder bis die Oberfläche vollständig trocken ist.
Anmerkung: Achten Sie darauf, dass die Deckgläser absolut trocken sind, da eventuell vorhandene Flüssigkeit die Haftung der mikrofluidischen Systeme beeinträchtigt.
- Platzieren Sie mikrofluidische Geräte mit nach oben gerichteten Mustern für 10 Minuten unter UV-Licht in einer sterilen Umgebung (Biosicherheitswerkbank). Achten Sie darauf, sterile Verfahren einzuhalten, wenn Sie in der Biosicherheitswerkbank arbeiten10.
- Platzieren Sie mit einer Pinzette ein mikrofluidisches Gerät mit einem Muster nach unten in Kontakt mit dem sauberen Deckglas/der Schale. Drücken Sie mit der Pinzette sanft auf das Gerät, sodass es am Glas haftet.
Anmerkung: Die Transparenz des verklebten Bereichs wird sichtbar, wenn man gegen das Licht schaut. Stellen Sie sicher, dass alle Ecken mit dem Glas in Kontakt sind. Tun Sie dies mit allen mikrofluidischen Geräten. Siehe Abbildung 1a.
- Um das Gerät mit einer einzigen Population mit Medium zu füllen, richten Sie die Pipette auf die Kanäle und geben Sie 50 μl vollständiges Zellmedium, ergänzt mit serumfreiem B-27 (Volumenverhältnis 1:50) und 500 μg/ml Penicillin/Streptomycin/Glutamin (zusammen NBM genannt), in die rechte obere Vertiefung und fügen Sie dann weitere 50 μl in die diagonal dazu liegende Vertiefung hinzu. Tun Sie dies für alle Geräte und stellen Sie sicher, dass das Medium zwischen den Vertiefungen fließt. Geben Sie als Nächstes 50 μl Medium in die verbleibenden zwei Vertiefungen. Siehe Abbildung 3a.
- Um das Gerät mit mehreren Populationen mit Medium zu füllen, richten Sie die Pipette auf die Kanäle und geben Sie 30 μl vollständiges NBM in die richtigen Vertiefungen, siehe Abbildung 2a. Tun Sie dies für alle Geräte und stellen Sie sicher, dass das Medium zwischen den Vertiefungen fließt. Geben Sie anschließend 50 μl Medium in die verbleibenden vier Vertiefungen.
- Stellen Sie die Geräte in eine größere Platte mit einer offenen Schale mit autoklaviertem Wasser (Nasskammer) und stellen Sie sie für 1-2 Stunden in den Inkubator (37 °C, 5 % CO 2 und 95 % Luftfeuchtigkeit), während Sie die Zellkultur vorbereiten. Siehe Abbildung 3b.
>2. Beschichtung von Neuronen in mikrofluidischen Systemen
- Nach einem Protokoll werden dissoziierte hippokampale oder kortikale Neuronen aus Embryonen der Sprague-Dawley-Ratte (beiderlei Geschlechts) gewonnen.
- Resuspendieren Sie embryonale Neuronen in NBM in einer Konzentration von 1-2 Millionen Neuronen/ml. Überprüfen Sie die Zellkonzentrationen am Mikroskop mit einem Hämozytometer und folgen Sie der Referenz8. Passen Sie die Zellkonzentration entsprechend der gewünschten Zelldichte an. Um die Chancen zu erhöhen, einzelne Hippocampus-Axone pro Kanal zu erhalten, plädieren Sie 10.000 Neuronen pro Gerät. Um mehrere Axone im selben Kanal zu haben, müssen 60.000 Neuronen pro Gerät erfasst werden.
Hinweis: Diese Zahlen variieren je nach verwendetem neuronalem Typ.
- Entfernen Sie das Medium aus den mikrofluidischen Geräten, ohne die Vertiefungen zu entleeren. Es verbleiben jeweils ca. 5 μl.
- Um Zellen in der Einzelpopulationsvorrichtung zu plattieren, geben Sie 50 μl NBM in die untere rechte Vertiefung. An dieser Stelle fließt das Medium von selbst, um die andere untere Vertiefung zu füllen. Geben Sie 20 μl der konzentrierten Zelllösung in die obere rechte Vertiefung des mikrofluidischen Geräts, wie in Abbildung 1b gezeigt.
- Um Zellen in der Vorrichtung mit mehreren Populationen zu plattieren, geben Sie 20 μl der konzentrierten Zelllösung in jede der richtigen Vertiefungen in Abbildung 2a.
- Überprüfen Sie im Mikroskop, ob sich Zellen in den Kammern befinden, und legen Sie die Geräte für 15-30 Minuten in den Inkubator, um die Zellanhaftung an das Substrat zu fördern.
- Prüfen Sie im Mikroskop, ob sich genügend Zellen in den Kammern befinden. Wenn mehr benötigt werden, wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5.
- Geben Sie 50 μl NBM in die 2 oberen Vertiefungen des Geräts mit einer Population und 20 μl NBM in dieselbe Vertiefung, in der die Zellen in das Gerät mit mehreren Populationen injiziert wurden. Das Medium ragt leicht hervor, um einen positiven Meniskus zu bilden, der den Vertiefungen ein Muffin-Top-Aussehen verleiht. Siehe auch hier Abbildung 3a.
- Halten Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
>3. Aufrechterhaltung der neuronalen Kulturen
- Entfernen Sie NBM (ca. 30 μl mit einer Pipette) aus den Zellen und tragen Sie am Tag nach ihrer Einführung in die Geräte (d. h. 1 Tag nach Schritt 2) neues vorgewärmtes NBM auf.
- Überprüfen Sie alle 2 Tage, ob in jedem Kanal genügend Medium vorhanden ist. Wenn der Muffindeckel niedrig ist, gib einfach mehr Medium in die oberen Vertiefungen.
- Kultivieren Sie Zellen für mindestens 7 Tage, bevor Sie die mikrofluidischen Geräte entfernen. Die Zellen können in diesen Geräten mehrere Wochen überleben. Entfernen Sie die Geräte 1-2 Tage vor der Durchführung von Experimenten an Proben.
>4. Entfernung von mikrofluidischen Geräten
- 1 - 2 Tage vor der Entnahme von mikrofluidischen Geräten 2 mL NBM auf 37 °C vorgewärmt in jede Probenschale geben, die Kammern fluten und die Geräte im Inkubator aufbewahren.
- Verwenden Sie eine sterile Pinzette und eine Spitze, um die mikrofluidischen Geräte von den Deckgläsern zu entfernen, so dass eine gemusterte Konfiguration der Neuronen zurückbleibt. Verwenden Sie die Spitze, um das Deckglas an Ort und Stelle zu halten, und die Pinzette, um die Kante des Geräts in der unteren linken Ecke der Vertiefung zu schließen. Wenden Sie vorsichtig eine Torsion an und heben Sie das Gerät mit der Pinzette an, so dass es sich vom Deckglas ablöst. Siehe Abbildung 3c-3d.
- Ersetzen Sie alle 2-3 Tage die Hälfte des NBM, bis die Probe für Experimente verwendet wird.
- Bevor Sie Experimente zur Neuverdrahtung an der Probe durchführen, stellen Sie sicher, dass die Neuriten in den Kanälen der Einzelpopulationsanlage und die neuronalen Populationen in der Vorrichtung mit mehreren Populationen isoliert sind, indem Sie die Lücken zwischen ihnen im Mikroskop untersuchen, um sicherzustellen, dass keine Filamente vorhanden sind, die die neuronalen Populationen verbinden.
>5. Vorbereiten von PDL-beschichteten Kügelchen
- Geben Sie 2 x 50 μl Tropfen von entweder 4, 10 oder 20 μm Polystyrolkügelchen, verdünnt in Wasser (1:500) zu 1 mL PDL (100 μg/ml). Mindestens 2 h bei Raumtemperatur ziehen lassen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert und am nächsten Tag fortgesetzt werden.
- Die Lösung wird 1 Minute lang bei 8.820 x g zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig entfernt, ohne die am Boden des Behälters angesammelten Kügelchen zu beschädigen.
- Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 1 mL steriler 10 mM HEPES pH 8,4 Lösung.
- Resuspendieren Sie die PDL-beschichteten Kügelchen in 200 mL 10 mM HEPES pH 8,4 Lösung.
>6. Mikropipetten vorbereiten
- Bereiten Sie Pipetten aus Glaskapillarröhrchen (1 mm Innendurchmesser, 1,5 mm Außendurchmesser) mit einem horizontalen Elektrodenabzieher vor. Passen Sie die Einstellungen so an, dass die äußere Spitze der gezogenen Mikropipette ~ 2-5 μm beträgt. Stellen Sie vor dem Ziehen sicher, dass die Glasröhren sauber sind.
- Befestigen Sie die Pipetten zur Aufbewahrung an Objektträgern und stellen Sie sicher, dass die Spitze nicht mit der Oberfläche des Objektträgers in Berührung kommt, da die Spitze zerbrechlich ist. Zum Schutz vor Staub bei Raumtemperatur in einem abgedeckten Behälter lagern. Verwenden Sie Pipetten am selben Tag, an dem sie gezogen werden.
>7. PDL-bead-Adhäsion an Neuronen
- Geben Sie 40-60 μl PDL-beschichtete Kügelchen, die in Schritt 5 hergestellt wurden, in eine in Schritt 4 vorbereitete Zellkultur. Zentrieren Sie die Pipettenspitze über den Neuronen, die auf dem Deckglas schwach sichtbar sind, und fügen Sie die Kügelchen hinzu (siehe Abbildung 4).
- Die Probe wird für 1 Stunde in den Inkubator zurückgestellt, um die Bildung synaptischer Kontakte zu fördern.
- Entfernen Sie nach der Inkubation alle nicht anhaftenden Kügelchen, indem Sie die Kultur vorsichtig mit vorgewärmtem NBM waschen.
>8. Herstellung physiologischer Kochsalzlösung (für Experimente bei Raumtemperatur)
- Bereiten Sie eine physiologische Kochsalzlösung vor. Dies dient dazu, die Zellumgebung außerhalb des Inkubators zu regulieren.
- Überprüfen Sie die Osmolarität und den pH-Wert.
- Kontinuierliche Infusion der Lösung mit O2, um pH-Schwankungen während der Durchführung von Experimenten zu minimieren.
- Auf Raumtemperatur erhitzen.
- Das Perfusionssystem wird eingerichtet, indem ein Ende eines Kunststoffröhrchens (optionale Abmessungen) in eine mit O2 infundierte physiologische Lösung eingeführt und das andere Ende an einer Nadel befestigt wird, die in den Probenhalter eingeführt wird. Platzieren Sie den Schlauch und die Lösung höher als die Probe (siehe Abbildung 5).
- Trennen Sie den Schlauch von der Nadel und verbinden Sie ihn mit einer Spritze. Verwenden Sie die Spritze, um Druck auszuüben und Flüssigkeit zu ziehen, indem Sie das Röhrchen füllen. Verschließen Sie mit einer Rollenklemme und schließen Sie die Nadel wieder an.
>9. Mikromanipulation von Kügelchen
- Installieren Sie die Probe in einem Versuchsaufbau so, dass die Zellen von oben mit zwei Mikropipetten, die in Mikromanipulatoren montiert sind, zugänglich sind und von unten optisch, z. B. mit dem 40X-Phasen-Objektiv (numerische Apertur von 0,6) eines inversen optischen Mikroskops. Montieren Sie in dieser Konfiguration eine CCD-Kamera für die Bildaufnahme an der Seitenöffnung des Mikroskops. Verbinden Sie jede Pipette über einen Kunststoffschlauch mit 1-ml-Spritzen. Ersetzen Sie in diesem Schritt NBM durch eine physiologische Kochsalzlösung (1-2 ml) (siehe Abbildung 5).
- Während der Experimente perfundierten Zellen kontinuierlich mit der in Schritt 8 hergestellten physiologischen Kochsalzlösung mit einer Geschwindigkeit von 0,5-1 ml/min.
- Wählen Sie im Sichtfeld eine PDL-Perle aus, die NICHT an ein Neuron gebunden ist. Richten Sie die Perle mit einer Mikropipettenspitze aus, indem Sie sich auf die Perle und dann auf die Mikropipette konzentrieren. Bringen Sie die Spitze so nah wie möglich an die Perle, indem Sie sie durch das Mikroskop überwachen.
- Üben Sie mit der 1-ml-Spritze, die an die Pipette angeschlossen ist, Unterdruck aus, um die Perle aufzunehmen. Halten Sie während des gesamten Experiments einen Unterdruck aufrecht.
10. Neuriten ziehen
- Wählen Sie eine PDL-Kugel aus, die an einem Neuron im Sichtfeld befestigt ist, und befestigen Sie sie durch Saugen an der zweiten Mikropipette, wie in den Schritten 9.3-9.4 beschrieben.
- Ziehen Sie den PDL-bead-neuron-Komplex langsam (~0,5 μm/min), bewegen Sie entweder den Mikromanipulator oder den Probentisch um 1 μm und pausieren Sie für 5 Minuten, um die Neuriteninitiierung zu ermöglichen.
- Wiederholen Sie Schritt 10.2 zweimal.
Hinweis: Die ersten 3 μm müssen sehr langsam gezogen werden, um den experimentellen Erfolg zu gewährleisten, der in über 95% der Fälle eintritt.
- Ziehen Sie den PDL-bead-neuron-Komplex langsam (~0,5 μm/min) und bewegen Sie entweder den Mikromanipulator oder den Probentisch um 2 μm und pausieren Sie für 5 Minuten, um die Neuritenverlängerung zu ermöglichen.
- Nach erfolgreicher Initiierung und Neuritenverlängerung für die ersten 5 μm ziehen Sie den Neurit mit 20 μm/min über Millimeterstrecken.
Hinweis: Das Ziehen kann kontinuierlich oder in Schritten und mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durchgeführt werden. Siehe Abbildung 6b-6c.
11. Neuronen verbinden
- Wählen Sie eine Region, die reich an Neuriten ist, und senken Sie den PDL-Perlen-Neuriten-Komplex so, dass er physisch mit ihm in Kontakt kommt. Verwenden Sie andere Perlen, um die Höhe der Spitze über der Deckglasoberfläche zu messen. Siehe Abbildung 6d.
- Lassen Sie den PDL-Bead-Neuriten-Komplex in Kontakt mit dem Zielneurit, während Sie die zweite Mikropipette manipulieren. Senken Sie die zweite Pipette mit dem zweiten PDL-Kügelchen auf den neu gebildeten Neuriten etwa 20 μm vom ersten Kügelchen ab. Verwenden Sie die zweite PDL-Perle, um das neue Neuritenfilament in Richtung der Zielzelle zu schieben.
- Halten Sie beide Kügelchen mindestens 1 Stunde lang an Ort und Stelle. Überprüfen Sie mit dem Mikroskop, ob es keine fokale Schwellung gibt, d. h. eine Verdickung der Neuriten, die mit der Perle in Kontakt kommen16.
- Während dieser Zeit wird das Medium der Probe durch Perfusion langsam von physiologischer Kochsalzlösung auf vorgewärmtes, CO2 -äquilibriertes NBM umgestellt.
- Lösen Sie die Perle von der zweiten Pipette, indem Sie den Sog loslassen. Wenn der neue Neurit anhaftet, löse auch die erste Perle. Siehe Abbildung 6e .
- Entfernen Sie vorsichtig die Kochsalzlösung und ersetzen Sie sie durch NBM (~2 mL).
- Legen Sie die Probe vorsichtig zurück in den Inkubator, um die neuronale Verbindung für zukünftige Experimente zu stärken. Diese Verbindung ist stabil für >24
