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>1. Vorbereitung von Hautfibroblasten für die Reprogrammierung
- Tauen Sie die adulten humanen dermalen Fibroblasten (aHDFs) mit einem automatisierten Zellauftausystem oder einem 37 °C warmen Wasserbad auf und plättieren Sie 200.000 pro T75-Kolben (Zählung mit einem automatisierten Zellzähler) in 10 ml Fibroblastenmedium (siehe Tabelle 1) bei 37 °C in 5 % CO2.
- Führen Sie am nächsten Tag einen kompletten Mediumwechsel mit Fibroblastenmedium durch.
- Wechseln Sie das Fibroblastenmedium alle 3–4 Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 95 % erreichen.
Anmerkung: Ein konfluenter Kolben enthält etwa 1.000.000 Zellen.
>2. Plattieren für die Neuprogrammierung (Tag −1)
HINWEIS: Es wird empfohlen, für kurzfristige Experimente (bis zu 30 Tage) eine Gelatinebeschichtung zu verwenden; alternativ wird für Langzeitexperimente empfohlen, mit einer Poly-L-Ornithin-, Fibronektin- und Lamininbeschichtung (PFL) zu beginnen.
- 60 Minuten vor dem Plattieren der aHDFs für die Reprogrammierung eine 24-Well-Platte mit 0,1 % Gelatine (250 μl/Well) beschichten und bei 37 °C inkubieren.
- Aspirieren Sie das Fibroblastenmedium auf den aHDFs. Einmal mit Dulbecco-Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (DPBS) waschen. Dissoziieren Sie die Zellen mit 0,05 % Trypsin (1,5 mL pro T75-Kolben) bei 37 °C für 3–5 Minuten.
- Fügen Sie Fibroblastenmedium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren (3 ml pro Spülung pro T75-Kolben) und sammeln Sie die abgelösten Zellen in einem 15-ml-Röhrchen, indem Sie die Zellen im Kolben zweimal ausspülen.
- Schleudern Sie die Zellen bei 400 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL Fibroblastenmedium.
- Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler (um eine gute Qualität der Umwandlung zu gewährleisten, überprüfen Sie, ob die Zellviabilität mit Trypanblau-Färbung über 90 % liegt).
- Für eine vollständige 24-Well-Platte bereiten Sie eine Suspension von 1.320.000 Zellen in 13,2 mL Fibroblastenmedium vor, um eine Suspension von 100.000 Zellen/ml Medium (oder 55.000 Zellen/Well in 550 μl Fibroblastenmedium multipliziert mit der Anzahl der benötigten Wells) zu erhalten.
- Die Gelatine von der Platte absaugen und zweimal mit DPBS waschen. Geben Sie 500 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C in 5 % CO2.
>3. Virale Transduktion (Tag 0)
HINWEIS: Die Arbeit mit lentiviralen Partikeln erfordert Ausrüstung der Kategorie 2 und die Verwendung eines Mittels zur Neutralisierung des Virus. Das Tragen von Doppelhandschuhen wird ebenfalls dringend empfohlen.
- Erwärmen Sie 13,2 mL Fibroblastenmedium auf 37 °C.
- Tauen Sie einen lentiviralen Vektor auf, der die Transkriptionsfaktoren achaete-scute-Familie bHLH-Transkriptionsfaktor 1 (Ascl1) und Brn2 mit zwei kurzen Hairpin-RNAs (shRNA) enthält, die auf den RE1-silencing Transkriptionsfaktor (REST) abzielen, bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie das notwendige Volumen an Lentivirus hinzu, um die aHDFs bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 20 auf das Medium ohne Transduktionsverstärker zu infizieren.
- Das Medium in der 24-Well-Platte wird durch Fibroblastenmedium ersetzt, das den lentiviralen Vektor (500 μl/Well) enthält, und über Nacht bei 37 °C in 5 % CO2 inkubieren.
- Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium in den Vertiefungen durch frisches Fibroblastenmedium ohne den lentiviralen Vektor.
Anmerkung: Das Medium gilt 7 Tage lang als infektiös und daher sollten in der ersten Woche nach der Virustransduktion angemessene Schutz- und Handhabungsverfahren angewendet werden.
>4. Wartung der konvertierenden Zellen
HINWEIS: Sobald die Umwandlung beginnt, sind die Zellen anfällig für Anhebung; achten Sie darauf, die Platte nach oben zu kippen und verwenden Sie eine 1.000 μl Pipette, wenn Sie das Medium entfernen, um ein Ablösen der Zellen zu vermeiden.
- An Tag 3 wird das Fibroblastenmedium entfernt und 500 μl frühes neuronales Konversionsmedium hinzugefügt (siehe Tabelle 1).
- Nehmen Sie zwei- bis dreimal pro Woche 225 μl altes Medium aus der Vertiefung und fügen Sie 250 μl frisches frühes neuronales Konversionsmedium hinzu.
- Entfernen Sie an Tag 18 das gesamte Medium aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch 500 μl spätes neuronales Konversionsmedium (siehe Tabelle 1).
- Wechseln Sie weiterhin die Hälfte des Mediums wie oben mit dem späten neuronalen Konversionsmedium alle 2–3 Tage bis zum Tag 25 oder dem Endpunkt des Experiments (Abbildung 1A).
Tabelle 1. Zusammensetzung der verschiedenen verwendeten Medien. Vollständige Beschreibung der Zusammensetzung der Medien, die in diesem Protokoll benötigt werden, einschließlich Fibroblastenmedium, frühes neuronales Umwandlungsmedium, spätes neuronales Umwandlungsmedium.
| Bestandskonzentration | Arbeitskonzentration |
| Fibroblasten-Medium |
| Basales Medium | N/A | N/A |
| Penicillin/Streptomycin | 10.000 U/ml | 100 mg/ml |
| FBS | N/A | 10 % |
| Frühes neuronales Umwandlungsmedium (ENM) | |
| Neuronales Differenzierungsmedium | N/A | N/A |
| Penicillin/Streptomycin | 10.000 U/ml | 100 mg/ml |
| CHIR99021 | ca. 10 mM | 2 μM |
| Nr. SB-431542 | ca. 20 mM | 10 μM |
| Birne | 100 μg/ml | 0,5 μg/ml |
| LDN-1931189 | ca. 10 mM | 0,5 μM |
| Freiwilliger Wirtschaftszweig | 1 Mio. | 1 mM |
| LM-22A4 | ca. 20 mM | 2 μM |
| GDNF | 20 μg/ml | 2 ng/ml |
| NT3 | 10 μg/ml | 10 ng/μL |
| db-cAMP | 50 mM | 0,5 mM |
| Spätes neuronales Umwandlungsmedium (LNM) | |
| Neuronales Differenzierungsmedium | N/A | N/A |
| Penicillin/Streptomycin | 10.000 U/ml | 100 mg/ml |
| LM-22A4 | ca. 20 mM | 2 μM |
| GDNF | 20 μg/ml | 2 ng/ml |
| NT3 | 10 μg/ml | 10 ng/μL |
| db-cAMP | 50 mM | 0,5 mM |
