Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung vor dem Schneiden
- Bereiten Sie Medien für die "Gewebeverarbeitung" und die "Scheibenkulturerhaltungsmedien" am Tag vor der geplanten Tumorresektion und Gewebeentnahme vor (oder verwenden Sie zuvor generierte Medien innerhalb von 2 Wochen). Fügen Sie 5 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung (10.000 U/ml) und 5 ml 1 M 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) zu 500 ml eines modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco mit hohem Glukosegehalt hinzu, um das Gewebeverarbeitungsmedium zu erzeugen.
- Bereiten Sie 250 ml Erhaltungsmedium für die Scheibenkultur unter Verwendung einer Basis aus neuronalem Medium (z. B. Neurobasal) ohne Phenolrot vor. Ergänzen Sie dieses Medium mit 10 mM HEPES, 1x B-27-Supplement, 400 μM L-Glutamin, 600 μM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 60 U/mL Penicillin, 60 μg/mL Streptomycin und 6 U/mL Nystatin.
- Lagern Sie alle Medien nicht länger als 2 Wochen bei 4 °C.
>2. Tag der Operation: Gewebeaufnahme
- Bereiten Sie am Tag der Gewebeentnahme 50 - 100 ml 1%ige und 2%ige (Gew./Vol.-%) Lösungen von Agarose bei niedriger Schmelztemperatur in Gewebeverarbeitungsmedien unter Verwendung von autoklavierten Glaswaren und steriler Technik in einer Laminar-Flow-Haube vor. Beide Konzentrationen von Agarose werden benötigt, um unvorhersehbare Schwankungen in der Konsistenz des Tumorgewebes auszugleichen.
- Die Agarose-Suspension in der Mikrowelle erhitzen, bis ein sanftes Sieden zu beobachten ist. Legen Sie die Agaroselösung in ein 37 °C heißes Wasserbad, um sie bis zur Verwendung in einem flüssigen Zustand zu halten.
- Geben Sie 1 ml Erhaltungsmedium für die Scheibenkultur in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte.
- Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um leere Kultureinsätze aus Polytetrafluorethylen (PTFE) in jede Vertiefung zu legen. Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten, wasserummantelten Gewebekultur-Inkubator mit einer 5 % CO2 -Atmosphäre, die bei 37 °C gehalten wird.
- Mit einer sterilen Pasteur-Pipette in einer Laminar-Flow-Haube wird vor der Tumorgewebeentnahme ein Gemisch aus 95 % O2/5 % CO2 -Gas etwa 15 bis 30 Minuten lang in einen Kolben mit eiskaltem Gewebeverarbeitungsmedium gegeben. Die Verwendung von suprasauerstoffhaltigen Medien minimiert die Hypoxie im Massengewebe während der Verarbeitung.
- Bereiten Sie markierte konische 50-ml-Röhrchen vor (ausreichend für die gewünschte Anzahl einzelner Tumorregionen, die isoliert werden sollen) mit 20 ml-Aliquoten von suprasauerstoffhaltigem, eiskaltem Verarbeitungsmedium, um das Gewebe zwischen dem Operationssaal und der Schneideanlage zu transportieren.
- Planen Sie in Zusammenarbeit mit einem Neurochirurgen präoperativ die Tumorregion für die Probenentnahme. Wählen Sie eine Tumorregion mit Kontrastmittelverstärkung aus, wie sie in der klinischen Bildgebung des Patienten gezeigt wird (T1-Post-Gadolinium-Magnetresonanztomographie (MRT)-Sequenzen). Bisherige Erfahrungen deuten darauf hin, dass dieser Bereich lebensfähiges Tumorgewebe im Gegensatz zu nekrotischem Gewebe liefert.
Anmerkung: Es wurde versucht, Schnitte aus der umgebenden (peritumoralen) weißen Substanz zu erzeugen; Die Hintergrund-Autofluoreszenz und die verminderte Tumorzelldichte schränkten jedoch den experimentellen Nutzen dieser Schnitte ein.
- Entnahme von Tumorgewebe zu Beginn der Tumorresektion. Vermeiden Sie die Entnahme von Tumorgewebe, das einem ausgedehnten bipolaren Kauter ausgesetzt ist, da dies die Lebensfähigkeit des Gewebes infolge einer thermischen Verletzung beeinträchtigen kann. Gewebeproben, die während der stückweisen Tumorresektion entnommen wurden, zeigen eine verbesserte Lebensfähigkeit im Vergleich zu Gewebe, das aus langwierigen En-bloc-Resektionen gewonnen wurde. Diese Beobachtung kann sich auf einen differentiellen Entzug des Blutflusses des Tumorgewebes als Folge einer chirurgischen Resektion und einer verlängerten Zeit bis zur Akquisition beziehen.
- Falls gewünscht, markieren und lagern Sie das Tumorgewebe in separaten konischen Röhrchen, um Proben aus unterschiedlichen Tumorregionen zu isolieren. (d.h. oberflächliches vs. tiefes Tumorgewebe). Genaue Gewebepositionen können aufgezeichnet werden, wenn eine intraoperative chirurgische Navigation verfügbar ist.
>3. Vorbereitung der Scheibenkultur
- Legen Sie Tumorgewebestücke in eine Petrischale mit eiskaltem Prozessmedium. Um das Tumorgewebe zu waschen und anhaftende rote Blutkörperchen zu minimieren, verwenden Sie eine Pipette, um das Medium in der Petrischale dreimal vorsichtig auszutauschen und zu entsorgen.
- Schneiden Sie Tumorstücke mit einem Skalpell in rechteckige Kastenformen. Schneiden Sie die Gewebestücke auf eine Größe von ca. 3 mm x 3 mm x 10 mm ab. Entfernen Sie anhaftende Gefäße vorsichtig durch Exzision oder sanftes Ziehen mit einer feinen Pinzette.
- 5 - 7 mL von 37 °C Agarose in eine kleine würfelförmige (~ 2 cm3) Kunststoff-Einbettform pipettieren. Vergewissern Sie sich vor der Verwendung, dass die Temperatur der Agaroselösung nicht mehr als 37 °C beträgt, mit einem sterilen Thermometer.
- Lassen Sie die Agarose ca. 1 Minute auf einem Eisbett ruhen.
- Platzieren Sie 2 - 4 Tumorgewebe-"Streifen" in Agarose, wobei die Längsachse vertikal ausgerichtet ist. Anmerkung: Gewebestreifen neigen dazu, in der Agarose zu "sinken", bevor sie sich verfestigen. Um diese Komplikation zu vermeiden, halten Sie den Gewebestreifen vorübergehend in vertikaler Ausrichtung, bis sich die Agarose weiter verfestigt hat.
- Bewahren Sie das Gewebe mit Agaroseschimmel für 2 - 5 Minuten auf einem Eisbett auf, um die Verfestigung zu erleichtern.
- Entfernen Sie den Schimmel vom Eis und entfernen Sie vorsichtig den Agaroseblock, indem Sie die Seiten der Form mit einem Skalpell abschneiden. Vermeiden Sie es, übermäßige Kraft auf den Block auszuüben, da dies die Agarose brechen kann.
- Verwenden Sie einen großzügigen Tropfen Cyanacrylatkleber, um den Agaroseblock auf der Vibratom-Probenplatte zu befestigen. Den Kleber ca. 1 - 2 Min. einwirken lassen.
- Füllen Sie das Vibrationsreservoir mit eiskaltem Prozessmedium, um den auf der Probenplatte befestigten Agaroseblock zu tauchen.
- Während des Schneidens blasen Sie ein 95 % O2 / 5 % CO2 -Gasgemisch durch eine zugeschnittene sterile Kunststoffpipette in das Vibratom-Reservoir.
- Stellen Sie die Dicke der Vibratomscheibe auf 300 - 350 μm ein.
- Passen Sie die Klingenvorschubgeschwindigkeit und die Klingenamplitude entsprechend der Gewebekonsistenz an. "Steiferes" Glioblastomgewebe erfordert langsamere Klingenvorschubgeschwindigkeiten und eine höhere Amplitude. Die genauen Einstellungen für die Klingengeschwindigkeit und die Amplitude variieren je nach den Vibrationsspezifikationen.
Anmerkung: Beim Schneiden treten häufig mehrere Probleme auf. Wenn sich der Gewebestreifen vom Agaroseblock löst, versuchen Sie, das Gewebe in einer höheren Konzentration von Agarose einzubetten. Wenn die Tumorscheiben dicker als gewünscht (Maschinensatz) oder asymmetrisch sind, erhöhen Sie die Amplitude und verringern Sie die Geschwindigkeit der Vibratom-Klinge. Um sicherzustellen, dass Tumorgewebe beim Schneiden nicht am Klingenhalter klebt oder von ihm "mitgezogen" wird, positionieren Sie den Mikrospatel vorsichtig zwischen dem Klingenhalter und der Schnitte, während sich die Klinge bewegt.
- Übertragen Sie die Gewebescheiben mit einem Mikrospatel aus Edelstahl mit eiskaltem Verarbeitungsmedium in die Petrischale.
- Entnehmen Sie 6-Well-Platten mit PTFE-Einsätzen und äquilibriertem Scheibenkulturmedium aus dem Inkubator (wie in Abschnitt 2, Schritt 4 vorbereitet).
- Teller werden mit einem Mikrospatel aus Edelstahl in Scheiben geschnitten. Minimieren Sie den direkten Kontakt und die Manipulation von Gewebe, indem Sie mit einem kleinen Pinsel mit feinen Borsten eine "Flüssigkeitswelle" erzeugen, um die Scheibe sanft vom Spatel auf den Kultureinsatz zu schieben.
Anmerkung: Minimieren Sie die Menge an Verarbeitungsmedien, die auf den Gewebekultureinsatz aufgebracht werden. Wenn übermäßige Medienmengen übertragen werden, die dazu führen, dass die Scheiben schwimmen, verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette, um das Medium zu entfernen.
- Die 6-Well-Platten mit den Tumorschnitten werden wieder in einen Inkubator gestellt, der bei 37 °C und 5 % CO2 -Atmosphäre gehalten wird.
Anmerkung: Das gesamte Embedding- und Slicing-Protokoll sollte innerhalb von 90 Minuten nach der Entnahme des Tumorgewebes aus dem Operationssaal abgeschlossen sein.
>4. Pflege der Slice-Kultur
- Nach 12 - 24 h übertragen Sie die Scheibenkulturen, indem Sie jeden Einsatzrand mit einer sterilen Pinzette greifen, und übertragen Sie sie auf Platten mit frischem Erhaltungsmedium für die Scheibenkultur. Stellen Sie sicher, dass das in jede Vertiefung aliquotierte Erhaltungsmedium der Scheibenkultur mindestens 15 Minuten lang im Inkubator äquilibriert wird, bevor Sie die Einsätze übertragen.
- Verschieben Sie die Einsätze alle 48 Stunden auf neue 6-Well-Platten mit frischen, äquilibrierten Scheibenkulturmedien.
- Falls gewünscht, aliquotieren Sie alte Scheibennährmedien mit einer Pipette für die sofortige Verwendung in biochemischen Assays oder frieren Sie sie für die zukünftige Verwendung bei -80 °C ein.
