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>1. Synthese von Gelatinemethacryloyl (GelMA)
- 10 g Gelatine aus Schweinehaut abwiegen und in 100 ml PBS auflösen, indem die Lösung auf einer Heizplatte bei 240 U/min und 50 °C gerührt wird, bis sie sich vollständig aufgelöst hat.
- Fügen Sie unter einer Haube 2 ml Methacrylanhydrid (MA) hinzu, um einen geringen Grad der Funktionalisierung zu erreichen, und lassen Sie die Gelatineemulsion bei 240 U/min und 50 °C für 2 h.
Vorsicht: MA Gefahrenhinweis: H302 + H332 (gesundheitsschädlich bei Verschlucken oder Einatmen), H311 (giftig bei Berührung mit der Haut), 314 (verursacht schwere Verbrennungen und Augenschäden), 315 (verursacht Hautreizungen), H317 (kann allergische Hautreaktionen hervorrufen), H318 (verursacht schwere Augenschäden), 331 (giftig bei Einatmen), H332 (gesundheitsschädlich bei Einatmen), H335 (kann Atemwegsreizungen verursachen). Hinweise zur Handhabung: P261 (Einatmen von Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dämpfen/Aerosol vermeiden), P305 + P351 + P338 + P310 (BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang vorsichtig mit Wasser spülen. Entfernen Sie die Kontaktlinsen, falls vorhanden und leicht durchzuführen. Fahren Sie mit dem Spülen fort. Rufen Sie sofort ein GIFTINFORMATIONSZENTRUM/einen Arzt an), P301 + P312 + P330 (BEI VERSCHLUCKEN: Rufen Sie ein GIFTINFORMATIONSZENTRUM/einen Arzt an, wenn Sie sich unwohl fühlen. Mund ausspülen).
Anmerkung: Fügen Sie MA sehr langsam hinzu, Tropfen für Tropfen.
- Verdünnen Sie die Gelatine-MA-Lösung in 100 mL vorgewärmtem PBS (50 °C), um ein Endvolumen von 200 mL zu erhalten, und lassen Sie die Lösung 10 Minuten lang bei 240 U/min und 50 °C rühren.
- Schneiden Sie ~20 cm Dialysemembran ab (molekularer Grenzwert 12-14 kDa) und weichen Sie sie in entionisiertem Wasser ein, bis sie weich ist.
Anmerkung: Füllen Sie die Membranen mit deionisiertem Wasser, um sicherzustellen, dass keine Löcher oder Defekte entstehen.
- Übertragen Sie die Gelatine-MA-Lösung mit einem Trichter auf die Membranen.
Anmerkung: Schließen Sie beide Seiten und lassen Sie zusätzlichen Platz im Inneren, um eine Mischung zu ermöglichen.
- Die Membranen, die die Gelatine-MA-Lösung enthalten, werden in ein Gefäß mit 2 l destilliertem Dialysewasser gegeben und 5 Tage lang bei 40 °C (500 U/min) gerührt.
Anmerkung: Decken Sie den Behälter ab, um Wasserverdunstung zu vermeiden.
- Wechseln Sie das destillierte Wasser zweimal täglich. Drehen Sie die Membranen jedes Mal zur Homogenisierung auf den Kopf.
- Am fünften Tag 200 ml vorgewärmtes Reinstwasser (40 °C) mit der dialysierten Gelatine-MA mischen und 15 min bei 40 °C rühren.
- Die Gelatine-MA-Lösung in konische 50 mL-Röhrchen bis 25 mL überführen und die Röhrchen 2 Tage lang bei -80 °C stehen lassen.
Anmerkung: Lagern Sie die Röhrchen horizontal, um die Gefriertrocknung zu erleichtern.
- Lyophilisieren Sie die gefrorenen Lösungen für 3-5 Tage und lagern Sie das lyophilisierte GelMA vor Feuchtigkeit geschützt.
>2. Vorbereitung der Biotinte
HINWEIS: Um 1 mL Biotinte zu erhalten, wird empfohlen, mindestens 3 mL Biomateriallösung herzustellen, da es während der Filtration zu Verlusten kommen kann.
- Herstellung der Fibrinogenlösung
- Bereiten Sie Kochsalzlösung (NaCl 0,9%) in entionisiertem Wasser vor und lösen Sie 10 mg Fibrinogen aus Rinderplasma in 1 ml der Kochsalzlösung, um eine Konzentration von 10 mg/ml zu erhalten
Anmerkung: Da Fibrinogen an Glas adsorbiert, verwenden Sie keine Glaskolben zur Herstellung der Fibrinogenlösung.
- Die Lösung wird bis zur vollständigen Auflösung des Fibrinogens bei 37 °C umgerührt.
HINWEIS: Verwenden Sie zum Auflösen von Fibrinogen ein Rotationssystem, das in einem Ofen bei 37 °C aufgestellt wird. Ein magnetisches Rühren (180 U/min) von Fibrinogen auf einer heißen Platte bei 37 °C ist ebenfalls geeignet. Unter dieser Bedingung dauert es etwa 40 Minuten, bis sich 10 mg/ml Fibrinogen aufgelöst haben.
- Herstellung von Gelatine/GelMA-Lösung
- Wiegen Sie 0,12 g Gelatine und fügen Sie sie zu 1,9 ml vorgewärmtem PBS (40 °C) hinzu, um eine Endkonzentration von 4 % (w/v) Gelatine zu erhalten. Vortex, um die Auflösung zu erleichtern.
- Halten Sie die Emulsion bis zur vollständigen Auflösung bei 40 °C.
- Wiegen Sie 0,06 g lyophilisiertes GelMA und geben Sie es in die Gelatinelösung, um eine Endkonzentration von 2 % (w/v) GelMA zu erhalten. Vortex, um die Auflösung zu erleichtern.
- Halten Sie die Lösung bis zur vollständigen Auflösung bei 40 °C.
>3. Herstellung von Astrozyten-beladener Gelatine/GelMA/Fibrinogen-Biotinte
- 0,9 ml der 10 mg/ml-Fibrinogenlösung pipettieren und in die Gelatine/GelMA-Lösung überführen, um eine Endkonzentration von 3 mg/ml Fibrinogen zu erhalten.
- 0,015 g Photoinitiator (PI) wiegen und in die Gelatine/GelMA/Fibrinogen-Lösung überführen, um eine Endkonzentration von 0,5 % (w/v) PI zu erhalten. Mischen Sie die Lösung, indem Sie das Röhrchen auf und ab drehen und bei 40 °C vor Licht geschützt aufbewahren, um eine PI-Degradation zu vermeiden.
Anmerkung: Lagern Sie die Biotinte bei 4 °C für maximal 24 h.
- Unter der laminaren Strömung wird die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter in ein steriles konisches 15-ml-Röhrchen filtriert.
Anmerkung: Die Biomateriallösung sollte eine Temperatur von 37-40 °C haben, um eine Filtration zu ermöglichen.
- 980 μl der Biomateriallösung in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführen.
- Verdünnen Sie Laminin in Kochsalzlösung, um eine Stammlösung von 100 μg/ml zu erhalten.
- 20 μl Laminin pipettieren und in das Röhrchen mit der Biotinte geben, um eine Endkonzentration von 2 μg/ml Laminin zu erhalten.
- Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren und Blasen vermeiden. Wenn Blasen bestehen bleiben, zentrifugieren Sie das konische Röhrchen bei 200 x g für 2 min. Halten Sie die Biotinte bei 37 °C, bis sie mit den Zellen vermischt ist.
- Trypsinisieren Sie primäre Astrozyten mit 0,05% Trypsin für 5 min.
Anmerkung: Verwenden Sie Astrozyten aus den Passagen 1 bis 3.
- Neutralisieren Sie die Trypsinaktivität mit FBS im Verhältnis 1:1 und übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie es bei 200 x g für 5 min.
- Zählen Sie die Zellen und geben Sie 1 x 106 Zellen in ein anderes konisches Röhrchen. Zentrifugieren Sie es bei 200 x g für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie ein kleines Volumen (~200 μl) übrig, um das Zellpellet aufzuhängen, indem Sie vorsichtig auf den Boden des konischen Rohrs klopfen.
- Übertragen Sie 1 ml Gelatine/GelMA/Fibrinogenlösung in das Röhrchen mit den Zellen und pipettieren Sie zum Homogenisieren vorsichtig auf und ab, um eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erhalten.
>3. Vorbereitung der Vernetzerlösung
- Rekonstitution von Thrombin
- Bereiten Sie eine Stammlösung von Thrombin 100 U/ml in sterilem deionisiertem Wasser mit 0,1 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in einem konischen 15-ml-Röhrchen vor. Lager in Mikroröhrchen bei -20 °C.
HINWEIS: Da Thrombin an Glas adsorbiert, verwenden Sie keine Glaskolben zur Herstellung der Stammlösung oder zur Lagerung der Aliquote.
- Herstellung von Thrombin-CaCl2-Lösung
- 100 μl Thrombin-Stammlösung pipettieren und in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 8,9 ml sterilem deionisiertem Wasser überführen, um eine Endkonzentration von 1 U/ml Thrombin zu erhalten.
- Bereiten Sie eine 10%ige (w/v) CaCl2-Lösung in entionisiertem Wasser vor und sterilisieren Sie sie mit einem 0,2-μm-Filter.
- 1,1 ml der 10%igen CaCl2-Lösung werden in das konische Röhrchen mit Thrombin überführt, um ein Endverhältnis von 1:9 (CaCl2 zu Thrombin) zu erhalten.
Anmerkung: Bereiten Sie die Vernetzerlösung auf dem Volumen für das Experiment vor und vermeiden Sie Lagerung.
>4. Bioprinting von Astrozyten-beladener Biotinte mit einem extrusionsbasierten Bioprinter
- Aufbau des Nervengewebes
- Unter Verwendung des G-Codes: Konstruieren Sie ein Raster von 6 x 6 mm (quadratische Form) mit einem Abstand von 1 mm zwischen jeder biogedruckten Linie auf der X- und Y-Achse und 6 Schichten auf der Z-Achse (0,2 mm zwischen jeder Linie), stellen Sie die Extrusion (E) auf 0,01 mm ein und erhöhen Sie sie bei jeder neuen Schicht der Z-Achse um 0,001 mm und stellen Sie die Druckgeschwindigkeit (F) auf 400 mm/min ein (Ergänzende Informationen).
- Bioprinter einrichten
- Setzen Sie die Maschine 15 Minuten lang UV-Licht aus und wischen Sie sie dann mit Ethanol 70 % ab.
- Schalten Sie den Bioprinter mit dem Netzschalter ein. Verbinden Sie das Gerät über ein USB-Kabel mit dem Computer. Öffnen Sie die Steuerungssoftware, um sie mit dem Bioprinter zu verbinden und das Dateidesign zu laden.
- Vorbereitung der Bioprinting-Spritze
- Übertragen Sie die mit Astrozyten beladene Gelatine/GelMA/Fibrinogen-Biotinte mit einer 1.000-μl-Pipette auf eine 5-ml-Kunststoffspritze.
Anmerkung: Langsam übertragen, um Blasenbildung zu vermeiden.
- Verbinden Sie eine sterile stumpfe 22-G-Nadel mit der Spritze.
Anmerkung: Lassen Sie die Spritze 2 Minuten lang bei 4 °C.
- Schließen Sie die Spritze an den Druckkopf des Bioprinters an und spülen Sie die Biotinte manuell, um die verbleibenden Blasen zu entfernen.
- Bioprinting
HINWEIS: Das Bioprinting wurde außerhalb der Laminarhaube durchgeführt.
- Stellen Sie eine 35-mm-Kulturschale auf den Biodruckertisch und positionieren Sie die Nadel 0,1 mm von der Oberfläche der Kulturschale entfernt, um die Bewegung der Nadel zu ermöglichen.
HINWEIS: Verwenden Sie für jedes Bioprinting eine 35-mm-Kulturschale.
- Drücken Sie die Drucktaste.
- Sobald das Bioprinting abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass sich die Spritze von der Schale entfernt. Schließen Sie dann die Kulturschale und bereiten Sie sich auf den Vernetzungsprozess vor.
Anmerkung: Das Bioprinting eines Konstrukts dauert ca. 1 min und 10 s.
- Vernetzung des biogedruckten Konstrukts und der Kultur
- Stellen Sie die Kulturschale für 2 x 60 s (nach oben und unten) unter UV-Licht bei 2 mW/cm2 für die GelMA-Vernetzung
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- Übertragen Sie das biogedruckte Konstrukt unter der laminaren Strömung mit einem sterilen Spatel auf eine 24-Well-Platte.
- 500 μl Thrombin/CaCl2-Lösung zugeben und 30 Minuten einwirken lassen, damit die Fibrinvernetzung möglich ist.
- Entfernen Sie die Vernetzungslösung und waschen Sie das Konstrukt mit 2 mL PBS 1x. Ersetzen Sie dann das PBS durch 1 ml Astrozyten-Kulturmedium und inkubieren Sie bei 37 °C und 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage.