Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Thiolierung von Hyaluronsäure
HINWEIS: Molverhältnisse werden in Bezug auf eine Gesamtzahl von Carboxylatgruppen angegeben, sofern nicht anders angegeben.
- 500 mg Natriumhyaluronat (HA, 500-750 kDa) bei 10 mg/ml in entionisiertem, destilliertem Wasser (DiH2O) werden in einem autoklaviersterilisierten 250-ml-Erlenmeyerkolben gelöst. Rühren Sie die Lösung (~200 U/min) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur um, um HA vollständig aufzulösen. Verwenden Sie einen Rührstab und eine magnetische Rührplatte, um die Reaktion während des Thiolierungsvorgangs am Laufen zu halten.
- Stellen Sie mit 0,1 M Salzsäure (HCl) den pH-Wert der HA-Lösung auf 5,5 ein. Wiegen Sie 69,6 mg (0,25x molares Verhältnis) 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) ab.
Anmerkung: Obwohl ungelöstes EDC direkt zur HA-Lösung hinzugefügt werden kann, ist es in der Regel einfacher, EDC zuerst in 1 mL DiH2O aufzulösen und dann die EDC-Lösung schnell zur HA-Lösung hinzuzufügen. Die Vorauflösung von DiH2O in 1 ml kann auch mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Cystamindihydrocholorid erfolgen, bevor die Reaktion in den Schritten 1.3 und 1.4 ergänzt wird.
- Fügen Sie der Reaktion 17,9 mg (0,125x molares Verhältnis) NHS hinzu. Der pH-Wert der Reaktionslösung wird mit 0,1 M HCl auf 5,5 eingestellt und die Reaktion 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
- 70,0 mg (0,25x molares Verhältnis) Cysamindihydrochlorid in die Reaktionslösung geben. Verwenden Sie 0,1 M Natriumhydroxid (NaOH), um den pH-Wert auf 6,25 einzustellen. Inkubieren Sie die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren.
- Am nächsten Tag wird der pH-Wert der Reaktionslösung mit 1 M NaOH auf etwa 8 eingestellt. Geben Sie 192 mg (4x molares Verhältnis) Dithiothreitol (DTT) zur Reaktion. Stellen Sie den pH-Wert nach der Zugabe von DTT wieder auf 8 ein und lassen Sie es 1-2 Stunden lang bei Raumtemperatur rühren.
- Verwenden Sie 1 M HCl, um den pH-Wert auf 4 einzustellen. Das gesamte Reaktionsgemisch wird in eine vorgetränkte Dialysemembran überführt (Molekulargewichtsgrenzwert um 13 kDa) und dialysiert gegen DiH2O, voreingestellt auf pH 4,
Anmerkung: Das Volumen von DiH2O für die Dialyse sollte mindestens das 40-fache des Volumens der umgesetzten HA-Lösung betragen (z. B. 50 ml Probe in 2 l DiH2O, pH 4).
- Ersetzen Sie die Dialyselösung (DiH2O, pH 4) zweimal täglich für 3 Tage bei Raumtemperatur.
- Die dialysierte Lösung wird durch einen vakuumbetriebenen Membranfilter mit 0,22 μm filtriert. Schockfrostlösung von thioliertem HA in flüssigem Stickstoff. Verwenden Sie einen Gefriertrockner, um trockene Proben über 2 Tage einzufrieren. Thioliertes HA in trockener Form kann in einem vakuumversiegelten Exsikkator bei -20 °C mindestens 6 Monate gelagert werden.
- Um den Grad der Thiolierung zu bestimmen, verwenden Sie den Ellman-Test und/oder die Protonen-NMR-Spektroskopie.
>2. Vorbereitung von Vernetzungsmaterialien
- Lösen Sie thioliertes HA in der gewünschten Konzentration (in diesem Beispiel 13,3 mg/ml) in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (20 mM HEPES in Hanks HBSS-Puffer, angepasst an einen pH-Wert von 8-9) in einem braunen Fläschchen, um die Exposition gegenüber Umgebungslicht zu minimieren. Lassen Sie die Lösung ständig rühren.
Anmerkung: Die Bildung von Disulfidbindungen zwischen Thiolen, die an HA konjugiert sind, kann auftreten, wenn der pH-Wert über 8 liegt, die Lösungskonzentration zu hoch ist oder die Lösung vor der Gelierung zu lange gerührt wird. Um dieses Problem zu vermeiden, verwenden Sie weniger als 15 mg/ml thioliertes HA und lösen Sie thioliertes HA innerhalb von 2 Stunden nach der Bildung von Hydrogelen auf.
- 4-armiges PEG-maleimid (PEG-Mal, 20 kDa) und 4-armiges PEG-Thiol (PEG-Thiol, 20 kDa) werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, gelöst, um 50 mg/ml PEG-Mal- und PEG-Thiol-Stammlösungen herzustellen.
Anmerkung: Es dauert mindestens 1 Stunde, um PEG-Reagenzien vollständig aufzulösen.
- Wenn Sie ECM-abgeleitete Peptide hinzufügen, lösen Sie Cystein-haltige Peptide in PBS auf, um eine Stammlösung herzustellen.
Anmerkung: Verwenden Sie eine Stammkonzentration von 2-4 mM.
- Weichen Sie Silikonkautschukformen mindestens 20 Minuten lang in Ethanol ein, um sie zu reinigen, und autoklavieren Sie sie dann zur Sterilisation.
>3. Hydrogel-Vernetzung und Zellverkapselung
HINWEIS: Als Beispiel wird hier die Verkapselung von vier einzelnen 80 μl Hydrogelen mit 0,5 % (w/v) HA und einem Druckmodul von 1 kPa beschrieben3. Bitte beachten Sie Tabelle 1, z. B. Rezepte, die Hydrogele mit unterschiedlichen Eigenschaften ergeben: zwei Hydrogele mit dem Integrin-bindenden Peptid RGD und zwei Hydrogele mit Cystein-Kappen als Negativkontrolle für die Peptidaktivität. Die Seeding-Konzentration von patienteneigenen GBM-Zellen beträgt 500.000 Zellen/ml.
- Verdünnen Sie die PEG-Mal-Stammlösung (50 mg/ml, aus Schritt 2.2) auf 12,5 mg/ml, indem Sie 40 μl der Stammlösung zu 120 μl PBS hinzufügen. Die verdünnte Lösung wird in zwei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit jeweils 80 μl aufgeteilt.
- Geben Sie 16 μl Stamm-RGD-Lösung (2,8 mM, aus Schritt 2.3) in ein Röhrchen und 16 μl Stamm-Cysteinlösung (2,8 mM, aus Schritt 2.3) in das zweite Röhrchen. Vortex zum Mischen. Die PEG-Mal-RGD- oder PEG-Mal-CYS-Lösungen bis zur Verwendung in Schritt 3.9.
auf Eis legen
Anmerkung: Das hier beschriebene Verfahren liefert Hydrogele mit ~140 μM Peptid. Dies entspricht etwa 1 von 8 verfügbaren PEG-Armen, die mit einem Peptid besetzt sind. Dies kann variiert werden, indem das molare Verhältnis von Cystein-terminierten Peptiden zu verfügbaren Maleimidgruppen verändert wird. Im Allgemeinen kann eine maximale Konzentration von 280 μM Peptid erreicht werden, während immer noch eine ausreichende Anzahl von Maleimidgruppen für die Hydrogelvernetzung zur Verfügung steht.
- Die PEG-Thiol-Stammlösung (50 mg/ml, aus Schritt 2.2) auf 5 mg/ml verdünnen, indem 4 μl 50 mg/ml-Stammlösung mit 36 μl PBS gemischt werden. 120 μl gelöstes, thioliertes HA aus Schritt 2.1 werden der Mischung zugegeben.
Anmerkung: Lösungen von HMW HA sind sehr viskos. Daher empfehlen wir die Verwendung einer Mikropipettenspitze mit breiter Öffnung, um Lösungen zu übertragen. Pipettieren Sie langsam, um zu vermeiden, dass die Lösung an den Wänden der Mikropipettenspitze klebt, und um die Messgenauigkeit zu verbessern.
- Legen Sie die sauberen, trockenen Formen (vorbereitet in Schritt 2.4) in jede Vertiefung einer nicht mit Gewebekulturen behandelten 12-Well-Platte. Drücken Sie mit dem sauberen, stumpfen Ende einer Pipettenspitze auf die Gelform und überprüfen Sie die Abdichtung zwischen den Formen und dem Boden der Well-Platte.
Anmerkung: Überprüfen Sie die Dichtung kurz vor dem Verkapseln erneut, um ein Auslaufen zu vermeiden.
- Passagekultivierte GBM-Zellen, dissoziieren in Einzelzellen und bestimmen die Zellkonzentration wie zuvor beschrieben3.
Anmerkung: Einige GBM-Linien können nicht in einzelne Zellen dissoziiert werden. In diesem Fall können ganze Gliomsphären eingekapselt werden. Bereiten Sie jedoch dissoziierte Einzelzellen nach präziser Zellzählung vor, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern. Das Protokoll für die Gliomsphären-Passage variiert von Labor zu Labor, und viele von ihnen sind wahrscheinlich mit der Hydrogel-Verkapselung kompatibel.
- (Empfohlen) Zentrifugieren Sie die Gliomsphären bei 500 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie dem Zellpellet 1 ml Zelldissoziationsenzym hinzu. Dann 5 Minuten inkubieren und vorsichtig auf das Röhrchen klopfen, um es zu bewegen.
- Geben Sie 4 ml vollständiges Kulturmedium (50 ng/ml EGF, 20 ng/ml FGF-2, 25 μg/ml Heparin, G21-Supplement und 1 % Penicillin/Streptomycin in DMEM/F12) in die Zellen.
- Erneut bei 500 x g für 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen. Zum Schluss resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL des gesamten Mediums und passieren die suspendierten Zellen durch ein 70 μm Zellsieb. (Empfohlen) Waschen Sie das Sieb mit zusätzlichen 4 ml des gesamten Mediums, um die Anzahl der zurückgewonnenen Zellen zu maximieren.
- Schätzen Sie die Konzentration der Zellen in der Suspension mit einem Hämozytometer. Teilen Sie die Zellsuspension in 2 Zentrifugenröhrchen auf, wobei jedes Röhrchen ~80.000 Zellen enthält. Zentrifugieren bei 500 x g für 5 min; Im Allgemeinen ergeben 80.000 Zellen 2 80 μl Hydrogele.
- Der Überstand wird entfernt und ein Pellet in 80 μl PEG-MAL-RGD-Lösung und ein zweites Pellet in 80 μl PEG-MAL-CYS-Lösung (hergestellt in Schritt 3.1) resuspendiert.
- Geben Sie mit einer 200-μl-Mikropipettenspitze mit breiter Öffnung 40 μl HA-Lösung (aus Schritt 3.3 oben) in jede Gummi-Silikonform (wie in Schritt 3.4 vorbereitet).
- Mischen Sie mit einer 200-μl-Mikropipettenspitze mit breiter Öffnung die 40 μl PEG-MAL-CYS- oder PEG-MAL-RGD-Zelllösung mit der HA-Lösung in der Form. Pipettieren Sie schnell auf und ab, nicht mehr als 10 Mal. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Gelkultur, die gerade vorbereitet wird.
Anmerkung: Dieser Schritt erfordert Übung, da die erste Gelierung schnell (innerhalb von 30 s) erfolgt. Pipettieren Sie auf und ab, während Sie die Spitze an verschiedene Stellen in den Formen bewegen, um ein gleichmäßiges Mischen zu gewährleisten. Halten Sie die Spitze immer unter dem Flüssigkeitsspiegel, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Mischen Sie die Lösung nicht zu oft, da sich in der Mikropipettenspitze Gel bilden kann. PEG-MAL-CYS und PEG-MAL-RGD können in unterschiedlichen Verhältnissen kombiniert werden, um die gewünschte RGD-Peptidkonzentration zu erreichen.
- Legen Sie die Well-Platte mit den gelverkapselten Zellen für 5-10 Minuten in einen 37 °C heißen Zellkultur-Inkubator, um den Abschluss der Reaktion sicherzustellen.
- Geben Sie 2-2,5 ml Kulturmedium in jede Vertiefung mit geformten Gelen. Verwenden Sie eine sterile 2-μl-Pipettenspitze oder einen Mikrospatel, um die Form und das Gel vorsichtig zu trennen. Verwenden Sie eine vorsterilisierte Pinzette, um die Form von der Well-Platte zu entfernen. Setzen Sie die Well-Platte zurück in den Zellinkubator (37 °C und 5 % CO2) für die Kultur und zukünftige Experimente.
Anmerkung: Ziehen Sie die Form vertikal nach oben, um die Gelkulturen nicht zu beschädigen. Im Allgemeinen sollte das Medium in Gelkulturen alle 3-4 Tage ausgetauscht werden. Achten Sie darauf, dass Sie beim Entfernen des Mediums keine Hydrogele aspirieren. Wenn dies ein Problem darstellt, empfehlen wir die Verwendung einer Transferpipette aus Kunststoff. Wenn eine Biolumineszenz-Bildgebung zur Verfolgung der Zellzahl geplant ist, müssen GBM-Zellen vor der Verkapselung mit Lentivirus-Expression transduziert werden, die konstitutiv für die Luciferase-Expression kodiert, wie zuvor beschrieben3. Für die Biolumineszenzbildgebung geben Sie 1 mM D-Luciferin 1 h vor der Lumineszenzbildgebung in das Kulturmedium.
