Ein Hydrogel auf Hyaluronsäurebasis für die 3-dimensionale Kultur von Glioblastomzellen

Abstract

Quelle: Xiao, W., et al. Hydrogele auf Hyaluronsäurebasis für die 3-dimensionale Kultur von Glioblastomzellen von Patienten. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt, wie Gliomsphären, die aus Hirntumoren stammen, in einzelne Zellen getrennt und in ein Hyaluronsäure-basiertes Hydrogel eingekapselt werden. Dieser Prozess fördert Zell-Zell-Interaktionen und bildet ein strukturiertes, dreidimensionales Glioblastom-Modell.

Protocol

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Thiolierung von Hyaluronsäure

HINWEIS: Molverhältnisse werden in Bezug auf eine Gesamtzahl von Carboxylatgruppen angegeben, sofern nicht anders angegeben.

1. 500 mg Natriumhyaluronat (HA, 500-750 kDa) bei 10 mg/ml in entionisiertem, destilliertem Wasser (DiH₂O) werden in einem autoklaviersterilisierten 250-ml-Erlenmeyerkolben gelöst. Rühren Sie die Lösung (~200 U/min) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur um, um HA vollständig aufzulö....

Results

Tabelle 1. Hydrogel-Formulierungen, die eine unabhängige Kontrolle der HA-Konzentration und der mechanischen Eigenschaften ermöglichen.

Gel-Typ	Teil A (je 40 μL)			Teil B (je 40 μL)
	4Arm-PEG-MAL (50 mg/ml)	Cystein oder.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
pH-Messgerät	Thermo Fischer	N/A	Jedes pH-Messgerät mit einer Empfindlichkeit von pH 2-10
Rührplatte	Thermo Fischer	N/A	Allgemeine Laborausstattung
Erlenmeyerkolben (125 ml)	Thermo Fischer	FB-501-125
2L Polypropylen-Becherglas	Thermo Fischer	Nr. S01916
Natriumhyaluronan	Lebenskern	HA700k-5	Bereich von 500 bis 750 kDa
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)	Thermo Fischer	PI-22980
N-Hydroxysuccinimid (NHS)	Sigma Aldrich	130672-5G
Salzsäure (HCl)	Thermo Fischer	SA48-500
Natriumhydroxid (NaOH)	Thermo Fischer	SS266-1
Cystaminedihydrochlorid	Thermo Fischer	AC111770250
Dithiolthreitol (DVB-T)	Thermo Fischer	Nr. BP172-25
Ellman-Testreagenz (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoesäure	Sigma Aldrich	D218200-1G
Deuteriertes Wasser (Deuteriumoxid)	Thermo Fischer	AC166301000
0,22 μm vakuumbetriebener Filter	CellTreat (Englisch)	229706
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Thermo Fischer	P32080-100T
Hanks' ausgewogene Salzsalzlösung (HBSS)	Thermo Fischer	MT-21-022-CV
4-armig-PEG-maleimid	JenKem Technologie	Nr. A7029-1	Molekulargewicht ca. 20kDa
4-armiges PEG-thiol	JenKem Technologie	Nr. A7039-1	Molekulargewicht ca. 20kDa
L-Cystein	Sigma Aldrich	C7880-100G
RGD ECM mimetisches Peptid	Genscript Biotechnologie	N/A	Kundenspezifisches Peptid mit der Sequenz "GCGYGRGDSPG", N-terminal sollte acetyliert werden
Silikon-Formen	Sigma Aldrich	GBL664201-25EA	Mit der Rasierklinge in einzelne Stücke schneiden
Vollständiges Kulturmedium	verschieden	verschieden	DMEM/F12 (Thermofisher) mit Nicht-Serum-Supplement (G21 von GeminiBio), epidermaler Wachstumsfaktor 50 ng/mL (Peprotech), Fibroblasten-Wachstumsfaktor 20 ng/mL (Pepro Tech) und Heprain 25μg/mL (Sigma Aldrich), Kulturmedium variiert je nach Labor
Vom Patienten stammende GBM-Zellen	N/A	N/A
Protease-/Phosphatasehemmer Mini-Tablette	Sigma Aldrich	5892970001
TrypLE express	Thermo Fischer	12604013
70μm Zellsieb	Thermo Fischer	Tel.: 22-363-548
Inkubator für Zellkulturen	Thermo Fischer	N/A	Jeder General mit 5% CO2 und 37C
Kühlschrank mit Gefrierfach	Thermo Fischer	N/A	Alle allgemeinen Laborgeräte mit einer Kapazität von -20 °C und -80 °C
Einweg-Einbettungsformen	Thermo Fischer	12-20
Pipettenspitzen mit breiter Öffnung	Thermo Fischer	9405120