>1. Vorbereitung vor organotypischen Kleinhirnschnittkulturen
- Bereiten Sie in einer zuvor mit 70 % Ethanol besprühten Zellkulturhaube 200 ml Kulturmedium in einem 250-ml-Flaschenaufsatz-Vakuumfilter vor, der an einem sterilen Flaschenbehälter befestigt ist. Fügen Sie 100 ml Basal Medium Eagle (BME), 50 ml Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 50 mL hitzeinaktiviertes Pferdeserum, 1 ml 200 mM L-Glutamin (Endkonzentration 1 mM) und 5 ml 200 g/l Glukose (Endkonzentration 5 mg/ml) hinzu. Den Nährboden vakuumfiltrieren und bis zu einem Monat lang bei +4 °C halten.
- Nehmen Sie in der sterilisierten Biosicherheitswerkbank eine 6-Well-Kulturplatte aus der Verpackung. Füllen Sie jede Vertiefung mit 1 ml Nährmedium. Wenn eine Behandlung getestet wird, geben Sie den pharmakologischen Wirkstoff in die behandelte Vertiefung und das gleiche Volumen der Vehikellösung für die Kontrollvertiefung. In der vorliegenden Studie fügten wir 1 μl sterile 3 M KCl-Lösung in die behandelte Vertiefung (30 mM final) und 1 μl steriles Wasser in die Kontrollvertiefungen hinzu.
- Bringen Sie die erforderliche Anzahl von einzeln verpackten Zellkultureinsätzen mit hydrophiler Polytetrafluorethylen (PTFE)-Membran (Porengröße = 0,4 μm) in die Zellkulturhaube. Packen Sie diese vorsichtig aus und nehmen Sie die Zellkultureinsätze mit einer sterilen Pinzette heraus. Lassen Sie sie nacheinander in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte fallen, um Blasen an der Grenzfläche zwischen der Einsatzmembran und dem Zellkulturmedium zu vermeiden. Lassen Sie die Inserts vor der Kultur mindestens 2 h lang in einem Inkubator mit 37 °Cund 5 % CO 2 im Medium äquilibrieren.
Anmerkung: Der Gewebehacker befindet sich dauerhaft in der Zellkulturhaube.
- Bereiten Sie zwei 200-ml-Becher vor, von denen eines mit 150 mL sterilem Wasser und das andere mit 150 mL 70 % Ethanol gefüllt ist. Tauchen Sie die chirurgischen Instrumente in das 70%ige Ethanolbad und dann in Wasser, bevor Sie sie verwenden.
Anmerkung: Verwenden Sie keine chirurgischen Instrumente unmittelbar nach dem Kontakt mit Ethanol.
- Desinfizieren Sie die zweischneidige Klinge im 70%igen Ethanolbecherglas. Legen Sie es mit einer sterilen Pinzette auf den Klingenhalter und halten Sie es mit dem Klingenklemmschlüssel fest. Lassen Sie es bis zur Verwendung trocknen.
- Desinfizieren Sie die mit dem Gewebezerkleinerer gelieferte Kunststoffscheibe im 70%igen Ethanolbecher. Besprühen Sie den Schneidetisch mit 70%igem Ethanol, bevor Sie die Scheibe darauf legen. Bis zur Verwendung trocknen lassen.
>2. Dissektion und zerebelläre organotypische Schnittkulturen
- Bringen Sie den Mäusewelpen in die Zellkulturhaube, um die Dissektion durchzuführen.
- Enthaupten Sie den Welpen schnell mit einer geraden Schere (Abbildung 1A).
- Während Sie den Kopf des Welpen mit einer geraden Verbandszange an der Nase halten, schneiden Sie die Kopfhaut mit einer Schere mit geradem Auge auf, beginnend am hinteren Ende und seitlich bis zur Mittellinie.
- Gehen Sie für den Schädel identisch vor.
Anmerkung: Achten Sie darauf, die Scherenspitzen nach außen zu richten, um das Kleinhirn während der Dissektion nicht zu beschädigen.
- Nehmen Sie das Gehirn heraus und geben Sie es in eine 60-mm-Schale, die mit kaltem HBSS + 5 mg/ml Glukose gefüllt ist.
- Präparieren Sie das Kleinhirn vorsichtig mit einer sterilen, geraden, feinen Pinzette (Abbildung 1B). Übertragen Sie es mit einer steril gebogenen feinen Pinzette auf die Kunststoffscheibe, die auf dem Schneidetisch des Gewebezerkleinerers platziert ist.
- Richten Sie das Gewebe aus, indem Sie den Schneidetisch drehen, um parasagittale Schnitte durchzuführen.
- Bewegen Sie den Schneidetisch, indem Sie den Entriegelungsknopf des Tisches nach rechts ziehen, so dass die Klinge am Rand des Gewebes positioniert ist.
- Stellen Sie die Scheibendicke auf 350 μm und die Klingengeschwindigkeit auf mittel ein.
- Starten Sie den Häcksler. Sobald das gesamte Kleinhirn aufgeschnitten ist (Abbildung 1C), schalten Sie den Zerkleinerer aus.
- Entfernen Sie die Kunststoffscheibe mit einer sterilen Pinzette.
- Bringen Sie die Kunststoffscheibe vorsichtig in die Nähe einer 60-mm-Schale, die HBSS + 5 mg/ml Glukose enthält. Pipettieren Sie kalte HBSS + 5 mg/ml Glukose mit einer sterilen Transferpipette auf das Gewebe, um die Entnahme von Kleinhirnscheiben in der mit Puffer gefüllten Schale zu ermöglichen.
- Trennen Sie die Kleinhirnscheiben mit einer Mikrosonde voneinander. Entnehmen Sie mit der Transferpipette qualitativ hochwertige Schnitte (es wird empfohlen, Gewebeschnitte zu verwenden, die sich in der Nähe der Vermis befinden) und geben Sie sie in einem voräquilibrierten Zellkultureinsatz ab (Abbildung 1D).
- Positionieren Sie die Kleinhirnscheiben mit der Mikrosonde auf dem Zellkultureinsatz und entfernen Sie dann vorsichtig die überschüssige HBSS + 5 mg/ml-Glukoselösung mit der Transferpipette.
Anmerkung: In diesem Stadium ist das Gewebe extrem empfindlich und anfällig für körperliche Schäden. Die maximale Anzahl an Kleinhirnschnitten pro Zellkultureinsatz hängt vom Alter des Spendertieres ab. Für ein P0–P4-altes Tier können 6–8 Scheiben kultiviert werden, für Tiere, die älter als P5 sind, können 4–6 Scheiben kultiviert werden.
- Stellen Sie die Kulturschale in den Inkubator und wechseln Sie das Medium alle 2–3 Tage vollständig.
- Um das Überleben der Purkinje-Zellen zu beurteilen, können die Scheiben bereits nach 5 Tagen in vitro entnommen werden. Zu anderen Zwecken können sie mehrere Wochen lang in Kultur aufbewahrt werden (Abbildung 1F).
Anmerkung: Im Falle von Purkinje-Zellüberlebensexperimenten besteht keine Notwendigkeit, die pharmakologische Behandlung bei einem Wechsel des Zellkulturmediums zu erneuern (Abbildung 1F).
>3. Immunfluoreszenz
- Nehmen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator. Entfernen Sie das Zellkulturmedium, waschen Sie den Zellkultureinsatz mit 1x PBS und fixieren Sie die Scheiben mit kalter 4%iger Paraformaldehydlösung für 1 h, mit 1 mL unter dem Zellkultureinsatz und 500 μL auf dem Zellkultureinsatz.
- Waschen Sie die Einlagen 4x 10 min mit 1x PBS, mit 1 mL unter und 500 μL auf der Einlage, auf einem Orbitalschüttler.
- Übertragen Sie die Kleinhirnscheiben mit einer Bürste von 1 Zellkultureinsatz in 1 Vertiefung einer 24-Well-Platte, die mit 1x PBS, 0,25 % Triton X-100 und 3 % BSA (PBS-TB), 500 μl/Well, vorgefüllt ist.
- Permeabilisieren und blockieren Sie die Scheiben durch Inkubation in PBS-TB für 1 h bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie mit Primärantikörpern, die in der PBS-TB-Lösung verdünnt sind, über Nacht bei + 4 °C auf einem Orbitalschüttler, 200 μl/Well.
- Führen Sie am nächsten Tag vier Waschgänge von 10 Minuten mit 1x PBS auf einem Orbitalschüttler mit 500 μL/Vertiefung durch.
- Inkubieren Sie mit Sekundärantikörpern, verdünnt in der PBS-TB-Lösung, zwei Stunden bei Raumtemperatur, auf einem Orbitalschüttler und lichtgeschützt, 200 μl/Well.
- Führen Sie vier Waschgänge von 10 Minuten mit 1x PBS auf einem Orbitalschüttler mit 500 μl/Well durch.
- Die Scheiben mit Hoechst 33342, verdünnt in 1x PBS (2 μg/mL), 10 min bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, 500 μL/Well, gegenfärben.
- Montieren Sie die Kleinhirnschnitte mit einer Transferpipette auf einen Mikroskopieobjektträger. Lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen und vor Licht geschützt werden. Befeuchten Sie sie erneut mit 1x PBS und tragen Sie ein Deckglas auf, das mit einigen Tropfen Eindeckmedium (~80 μL) bedeckt ist. Vermeide es, Blasen zu bilden.
- Sobald das Eindeckmedium ausgehärtet ist, können Kleinhirnschnitte abgebildet werden.
>4. Bildgebung und Quantifizierung des Zellüberlebens
- Schalten Sie das Mikroskop und die Laser laut Hersteller ein.
- Starten Sie die Erfassungssoftware.
- Lokalisieren Sie mit einem 10-fachen Objektiv nicht veränderte Kleinhirnschnitte mit 9–10 Läppchen (normalerweise Kleinhirnschnitte in der Nähe des Vermis).
- Aktivieren Sie die Z-Stack-Erfassung. Definieren Sie den Bereich des Z-Stapels so, dass alle Purkinje-Zellen im Kleinhirnschnitt enthalten sind. Stellen Sie eine Schrittweite von 2 μm ein und starten Sie die Erfassung. Speichern Sie das erfasste Bild im Format des Herstellers der Erfassungssoftware, um die zugehörigen Metadaten beizubehalten.
- Öffnen Sie die erfasste Datei in ImageJ mit dem Bio-formats-Plugin.
- Wechseln Sie zu Image > Stacks > Z-project... (Abbildung 2A).
- Wählen Sie im Dropdown-Menü Projektionstyp die Option Maximale Intensität aus und klicken Sie auf OK (Abbildung 2B).
- Es wird ein abgeflachtes 2D-Bild erzeugt. Doppelklicken Sie auf das Multipunkt-Werkzeug, um das Fenster Punkt-Werkzeug anzuzeigen. Deaktivieren Sie die Option Punkte beschriften, um die Visualisierung von gezählten Zellen zu vereinfachen. Klicken Sie dann direkt auf ein Soma einer Purkinje-Zelle, um mit der Zählung zu beginnen (Abbildung 1E). Die Gesamtzahl der gezählten Zellen wird am unteren Rand des Fensters Punktwerkzeug angezeigt (Abbildung 3).
Anmerkung: In der Regel können mindestens 3 unbeschädigte Abschnitte mit 9–10 Läppchen pro Zellkultureinsatz quantifiziert werden. Um die neuroprotektive Wirkung eines pharmakologischen Wirkstoffs zu beurteilen, sollten mindestens 3 unabhängige Experimente durchgeführt werden.
