Dissoziation und Kultivierung von Neuronen aus Gewebeproben des Hippocampus

Zusammenfassung

Quelle: Servello, D. et al., Ein mikrobiomechanisches System zur Untersuchung der Varikositätsbildung und -wiederherstellung in zentralen Neuronenaxonen. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt die Dissoziation und Kultur von Hippocampus-Neuronen aus Hippocampus-Gewebeproben unter Verwendung enzymatischer und mechanischer Dissoziationen. Die Behandlung mit Ara-C hemmt das Wachstum nicht-neuronaler Zellen und erleichtert so das selektive Wachstum von Hippocampus-Neuronen.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. Dissektion, Dissoziation und Kultur von Hippocampus-Neuronen aus schwangeren Mäusen/Ratten

1. Dissektion und Dissoziation von Hippocampus-Neuronen für die Kultur
   1. Tauen Sie die Protease-Enzymlösung (3 mg/ml Protease 23 in Slice Dissection Solution, SLDS, Tabelle 1) und das Plattierungsmedium (Tabelle 2) bei 37 °C vor.
   2. Präparieren Sie den Hippocampus und spülen Sie ihn mit SLDS.
      Anmerkung: Vier Hippocampi liefern genügend Zellen für eine 24-Well- oder eine 6-Well-Platte.
   3. Entfernen Sie das SLDS, fügen Sie 2 ml Proteaseenzymlösung hinzu und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 37 °C, 5 % CO₂.
   4. Waschen Sie die Hippocampus-Explantate zweimal mit 5-10 mL Plattierungsmedium. Fügen Sie 5 mL Beschichtungsmedium hinzu. Dissoziieren Sie Hippocampus-Explantate in einzelne Zellen, indem Sie mit einer Pipette mit einer 1-ml-Kunststoffspitze einen kleinen Wirbel erzeugen. Pipettieren Sie etwa 40 Mal auf und ab, um die Bildung von Sauerstoffblasen zu vermeiden, bis die Lösung trüb wird und keine großen Explantatstücke mehr übrig sind.
      Anmerkung: Denken Sie daran, während der Wäsche etwas Medium zu lassen, die Hippocampus-Explantate sollten während des gesamten Prozesses in das Medium eingetaucht bleiben.
   5. Die Zellen werden 3 min lang bei 1.125 x g zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand, während die Zellen in das Medium eingetaucht sind. Resuspendieren Sie die Zellen in 145 ml Beschichtungsmedium. Geben Sie 1 ml/Vertiefung der Zellsuspension auf eine 24-Well-Platte (3 ml/Vertiefung auf eine 6-Well-Platte).
      HINWEIS: 145 ml Beschichtungsmedium werden verwendet, um eine Zellsuspension mit geringer Zelldichte herzustellen. Dieses Volumen ermöglicht die Beschichtung von Zellen in sechs 24-Well-Platten, acht 6-Well-Platten oder verschiedene Kombinationen von 24- oder 6-Well-Platten, abhängig von den durchzuführenden Experimenten. Jede Vertiefung der 24-Well-Platte hat etwa 3 x 10⁴ Zellen.
   6. Inkubieren Sie die Zellen in den Beschichtungsmedien bei 37 °C, 5 % CO₂ für 2-4 h, entfernen Sie dann alle Beschichtungsmedien und ersetzen Sie sie durch frische Pflegemedien.
   7. Nach 2 Tagen (2 Tage in vitro, 2DIV) wird die Hälfte des Mediums durch 2 μM Ara-C (Arabinosylcytosin) ersetzt, das in Erhaltungsmedien gelöst ist und das Wachstum von Fibroblasten, Endothel- und Gliazellen hemmt. Nachdem Sie die Zellen zwei Tage lang Ara-C ausgesetzt haben, ersetzen Sie das Medium durch frische Erhaltungsmedien.

Tabelle 1: Deckglas-Beschichtungslösung. Liefert das Rezept für die Herstellung der Deckglas-Beschichtungslösung, die zum Anhaften von kultivierten Zellen an den Deckgläsern verwendet wird.

Deckglas-Beschichtungslösung
780 μL	Essigsäure17 mM Bestand: 50 μL Essigsäure in 50 mL H2O
200 μL	Poly-D-Lysin (0,5 mg/ml Stamm)
ca. 20 μl	Rattenschwanzkollagen (3 mg/ml Stamm)
Das Gesamtvolumen wird anhand der Anzahl der zu beschichtenden Deckgläser bestimmt.

Tabelle 2: Rezepte für Zellkulturmedien. Enthält die Rezepte für die Zubereitung von Medien, die bei der Kultivierung von primären Hippocampus-Neuronenzellen verwendet werden.

1x Scheibendissektionslösung (SLDS), gefiltert, pH= 7,4, lagern bei 4 °C
1 L	ddH2Ω
82 mM	Na2SO4
30 mM	K2SO4
ca. 10 mM	HEPES (freie Säure)
ca. 10 mM	D-Glukose
5 mM	MgCl2
0,00 %	Phenolrot (optional)
Beschichtungsmedien (PM, Filter, bei 4 °C lagern)
439 mL	MEM Earle's Salze
50 mL	FBS
11,25 ml	20% D-Glukose
5 mL	Natriumpyruvat (100 mM,)
62,5 μL	L-Glutamin (200 mM)
5 mL	Penicillin/Streptomycin (P/S, 100x)
Wartungsmedium (MM, Filter, bei 4 °C lagern)
484 mL	Neurobasal
10 mL	B27 50x Zuschlag
1,25 mL	L-Glutamin (200 mM)
5 mL	100x P/S
Alle Lösungen werden mit einem Filter mit einer Porengröße von 0,2 mm sterilisiert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12 mm Deckgläser	Warner Instruments	Tel.: 64-0702	Für 24-Well-Platten
25 mm Deckgläser	Fisher Scientific	Tel.: 12-545-102	Für 6-Well-Platten
Essigsäure	Fisher Scientific	Nr. A38-212
Poly-D-Lysin	Sigma	Nr. P6407
Kollagen für Rattenschwanz	Roche	Tel.: 11 179 179 001
10-fache PBS	Nationale Diagnostik	CL-253
Na2SO4	Fisher Scientific	Nr. S373-500
K2SO4	Fisher Scientific	Nr. P304-500
HEPES	Fisher Scientific	Nr. BP410-500
D-Glukose	Fisher Scientific	Nr. D16-500
MgCl2	Fisher Scientific	Nr. BP214-500
NaOH	Fisher Scientific	SS255-1
Protease-Enzym	Sigma	Nr. P4032
FBS	Gibco	Artikel-Nr.: 26140
Natriumpyruvat	Gibco	Artikel-Nr.: 11360-070
L-Glutamin	Gibco	25030081
Penicillin/Streptomycin 100x (P/S)	Gibco	15140122
MEM Earle's Salze	Gibco	Artikel-Nr.: 11090
B27 Beilage	Gibco	Artikel-Nr.: 17504-044
Neurobasal	Gibco	Artikel-Nr.: 21103-049
Arabinosylcytosin (Ara-C)	Sigma	Artikel-Nr.: 147-94-4
Opti-MEM Medien	Gibco	Artikel-Nr.: 31985-070