Erzeugung einer Organoidkultur aus einer Suspension von Hirntumorzellen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Sundar, S. J. et al.Erhaltung der zellulären Vielfalt des menschlichen Glioblastoms ex vivo mit Hilfe dreidimensionaler Organoidkultur. J. Vis. Exp. (2022).

Dieses Video beschreibt die Herstellung und Kultivierung von Hirntumor-Organoiden aus Einzelzellsuspension. Durch die Verwendung einer lamininreichen extrazellulären Matrix als Gerüst und Nährmedium für Nährstoffe werden die Zellen in die Lage versetzt, sich innerhalb des Organoids zu vermehren und selbst zu organisieren. Folglich werden ex vivo Organoide erzeugt, die die zelluläre Vielfalt und die Mikroumgebung von Hirntumoren nachahmen.

Protokoll

>1. Herstellung von Organoiden aus einer einzelligen Suspension

Legen Sie die lamininreiche extrazelluläre Matrix (lrECM) und ein kleines Zentrifugenröhrchen in einen Eiskübel oder einen kalten Block. Geben Sie die entsprechende Menge lrECM (16 μl x X Anzahl der vorgesehenen Organoide) in das kleine Zentrifugenröhrchen.
Erstellen Sie eine Mischung von Zellen in einem Gesamtvolumen (4 μL x X Anzahl der vorgesehenen Organoide), die 20.000 Zellen/Organoid enthält, und geben Sie diese in das kleine Zentrifugenröhrchen mit lrECM auf Eis.
Pipettieren Sie vorsichtig 20 μl des lrECM/Zellsuspensionsgemisches auf Parafilmformen, so dass ein perlenartiges Tröpfchen entsteht.
1. Achten Sie darauf, das lrECM/Zellsuspensionsgemisch gründlich zu mischen, da sich die Zellen in der lrECM leicht ansiedeln, was zu heterogenen Organoiden führt.
2. Bewahren Sie die lrECM/Zellsuspensionsmischung auf Eis auf. Wenn sich lrECM erwärmt, kann es polymerisieren und die Organoidbildung beeinträchtigen.
3. Achten Sie darauf, die Pipettenspitze alle zwei bis drei Organoide zu kühlen, um eine lrECM-Polymerisation zu verhindern. Führen Sie keine Luftblasen in Organoide ein (vermeiden Sie es, die Pipettenspitze "doppelt zu drücken").
Sobald die gewünschte Anzahl von Organoiden in einer 10-cm-Kulturplatte auf eine Parafilmform pipettiert wurde, inkubieren Sie bei 37 °C für 1-2 h in einem Zellkultur-Inkubator.
Nachdem sich die Organoide verfestigt haben, werden sie mit Neurobasal Media Complete (NBMc) (Tabelle 1) vorsichtig aus der Parafilmform gespült und in eine neue, sterile 10 cm große Kulturplatte mit insgesamt 20 ml NBMc gefüllt. Die Verwendung einer Pipette-1000 (p1000) Spitze funktioniert am besten, um Organoide von der Form zu spülen; Sie gleiten sanft ab.
Anmerkung: Empfohlen werden ca. 15-20 Organoide pro 10 cm Kulturschale.
Stellen Sie die 10 cm große Kulturschale für 4 Tage (ohne Schütteln) in einen Inkubator.
Nach 4 Tagen (Abbildung 1) tauschen Sie das Medium aus und legen Sie es bei 80 U/min in den Zellkultur-Inkubator. Tauschen Sie die Medien danach alle 2-3 Tage aus.
1. Der Austausch von Medien mit unausgereiften Organoiden ist eine Herausforderung, da sie schwer zu visualisieren sind. Kippen Sie die Zellkulturschale und warten Sie mindestens 20 Sekunden; Die Organoide setzen sich am Boden ab und ermöglichen eine langsame Entnahme des Mediums von oben mit einer Glaspipette mit großer Öffnung.
2. Achten Sie sorgfältig auf die Ansammlung von Organoiden am Boden; wenn sie durch die Kraft der Medienentfernung aufgewirbelt erscheinen, halten Sie inne und lassen Sie sie sich wieder absetzen. Wenn Organoide reifen und leichter zu visualisieren sind, wird dieser Prozess weniger nuanciert.
  Anmerkung: Manchmal kann das Platzieren eines dunklen Papiers unter der Zellkulturplatte helfen, unreife Organoide sichtbar zu machen. Verwenden Sie keine Pasteur-Pipette mit Vakuumabsaugung, um Medien zu entfernen, da die Organoide auf diese Weise sehr leicht aufgesaugt werden und verloren gehen.
3. Wenn Organoide zum ersten Mal etabliert werden, verbrauchen sie Medien nicht so schnell wie reife Organoide. Beginnen Sie mit einem Medienaustausch von 50 %, um unnötige Mediennutzung zu reduzieren und die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass während des Medienaustauschs versehentlich neue Organoide beschädigt oder aspiriert werden.

Tabelle 1: Neurobasales Medium vollständig (NBMc) Formulierung

Bestandteil	Menge
Neurobasales Medium minus Phenolrot	500 mL
B-27 Supplement minus Vitamin A (50x)	10 mL
Antibiotikum-Antimykotikum (100x)	5 mL
Natriumpyruvat (100 mM)	5 mL
Glutamin in 0,85% NaCl (200 mM)	5 mL
Rekombinante humane FGF basisch (250 μg/ml)	ca. 20 μl
Rekombinantes humanes EFG-Protein (250 μg/ml)	ca. 20 μl
Phenolrot	500 μL

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Ergebnisse

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Abbildung 1 zeigt das frühe Wachstum von Organoiden, das mittels Lichtmikroskopie bei 10-facher Vergrößerung zu sehen ist. Abbildung 1A zeigt in der mittleren Ansicht die Migration und Invasion einzelner Zellen durch lrECM. Die Zellen dehnen sich weiter aus und "besiedeln" das lrECM, und sie erscheinen durch visuelle Inspektion dichter und schließlich undurchsichtig. Abbildung 1B zeigt me...