Methodenartikel

Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen in Oligodendrozyten

8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Assetta, B., et al. Erzeugung menschlicher Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen. J. Vis. Exp (2020).

Dieses Video zeigt den Prozess der Erzeugung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) aus menschlichen embryonalen Stammzellen, gefolgt von der Reifung von OPCs zu Oligodendrozyten. Dieser Prozess der Erzeugung von Oligodendrozyten eröffnet zahlreiche Möglichkeiten, die Erforschung und Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich Alzheimer, zu verbessern.

Protokoll

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1. Induktion humaner Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) aus pluripotenten Stammzellen und Oligodendrozytenreifung

  1. Generierung von neuralen Vorläuferzellen (NPC): Monolayer-Protokoll (~7 Tage). Das Flussdiagramm finden Sie in Abbildung 1A.
    1. Verwenden Sie kommerziell erhältliche humane H1-ES-Zellen bei der Passage von 52 (siehe Materialtabelle). Kultivieren Sie die Zellen auf mit extrazellulärer Matrixlösung beschichteten 6-Well-Platten (~0,5 mg Matrixlösung pro 6-Well-Platte; siehe Materialtabelle) mit ES-Zellerhaltungsmedium (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Platten bei 37 °C mit 5 % CO2.
    2. Trans-Differenzierung der Zellen in neurale Vorläuferzellen (NPCs) durch einen etablierten Ansatz namens duales SMADi mit niedermolekularen Inhibitoren für mehrere Signalwege. Hier verwenden wir ein weithin akzeptiertes kommerzielles Kit und folgen dem vom Hersteller bereitgestellten Monolayer-Protokoll (siehe Materialtabelle).
    3. An Tag -1 0,5–1 x 106 Zellen pro Well in einer 6-Well-Platte, beschichtet mit einer wachstumsfaktorreduzierten Matrixlösung (siehe Materialtabelle; ~0,5 mg Matrixlösung pro 6-Well-Platte) mit Erhaltungsmedium für embryonale Stammzellen (ES) (siehe Materialtabelle). Diese Wachstumsfaktor-reduzierte Matrixlösung wird verwendet, um alle Platten zu beschichten, die in den folgenden Schritten verwendet werden.
    4. An Tag 0 werden die Zellen 24 Stunden lang mit ES-Zellerhaltungsmedium (siehe Materialtabelle) behandelt, das mit 2 % Dimethylsulfoxid (DMSO) ergänzt wird.
    5. Tauschen Sie das gesamte Medium an Tag 1 bis 6 durch ein warmes (37 °C) neuronales Induktionsmedium aus, das die SMAD-Inhibitoren aus dem kommerziellen Kit enthält (siehe Materialtabelle). Wenn sich Zellen teilen und vor Tag 7 einen Konfluenz erreichen, passieren Sie sie bis zur Aussaatdichte von 0,5–1 x 106, wie weiter oben in Schritt 1.1.3 beschrieben.
    6. An Tag 7 wird die Passage der NPCs mit einer Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle) und einer Platte mit einer Aussaatdichte von 1–2 x 105 Zellen/Well einer 24-Well-Platte durchgeführt.
    7. Effizienz der Assay-Differenzierung durch immunhistochemische (IHC) Färbung für das Fehlen von Pluripotenzmarkern wie OCT4 und das Vorhandensein von NPC-Markern wie PAX6, Nestin und Sox1.
    8. In diesem Stadium können abgelöste NPCs in den speziellen kommerziellen NPC-Gefriermedien (siehe Materialtabelle) eingefroren und bis zu 3 Monate in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Nach dem Einfrieren und Auftauen behalten NPCs immer noch die Multipotenz, um Neuronen, Astrozyten und OPCs mit zuverlässigen Protokollen hervorzubringen.
  2. Generierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) (~7 Tage). Das Flussdiagramm finden Sie in Abbildung 1A.
    1. An Tag 7 werden NPCs mit einer Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle) mit einer Aussaatdichte von 1–2 x 105 Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte in warmem (37 °C) neuronalem Induktionsmedium plus SMAD-Inhibitoren aus dem kommerziellen Kit (siehe Materialtabelle) pergiert.
    2. An Tag 8 wird eine Lösung von 1 % DMSO im OPC-Differenzierungsmedium hergestellt und die plattierten NPCs 24 Stunden lang behandelt. Das OPC-Differenzierungsmedium setzt sich zusammen aus: basalem (DMEM/F12) Medium, 1 % N2-Supplement, 1 % B27-Supplement, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) bei 20 ng/ml, geglättetem Agonisten (SAG) bei 1 μM, Thrombozyten-abgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF-AA) bei 10 ng/ml (siehe Materialtabelle).
    3. Ersetzen Sie an Tag 9 das Medium durch ein frisches OPC-Differenzierungsmedium ohne DMSO. Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag bis zum 15. Tag. Wenn die Zellen vor Tag 15 die Konfluenz erreichen, passieren Sie sie bis zur Aussaatdichte von 1–2 x 105 Zellen pro Well, wie in Schritt 1.2.1 beschrieben.
    4. An Tag 14 werden OPCs in OPC-Differenzierungsmedium mit einer Dichte von 1–2 x 105 Zellen/Well in einer 24-Well-Platte plattiert.
    5. In diesem Stadium (Tag 15) testen Sie die Zellen auf das Vorhandensein von OPC-spezifischen Markern durch immunhistochemische (IHC) Färbung oder quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) (z. B. O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa; Abbildung 1B) und für das Fehlen von NPC-Markern (Pax6 oder Nestin; Abbildung 1D). In der Regel weisen wir die O4-Immunreaktivität in mehr als 95% der Zellen am Tag 15 nach. Von besonderer Bedeutung für die Alzheimer-Krankheit ist die Expression von APP (Amyloid-Vorläuferprotein), BACE1 (die prozessierende Protease β-Sekretase 1) und Peptid-Amyloid-β (Aβ), die in OPCs reichlich vorhanden sind (Abbildung 1F).
  3. Reifung der Oligodendrozyten (OL) (~7–20 Tage)
    1. Ersetzen Sie das Medium an Tag 15 durch ein OL-Reifungsmedium: Neurobasal-A-Medium, 2% B27-Supplement, 1 μM zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), 200 ng/ml T3-Trijodthyronin und Clemastin von 1 μM (siehe Materialtabelle). Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag oder bei Bedarf täglich.
    2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen, teilen Sie sie im Verhältnis 1:3 bis zu 2 Durchgänge oder bis sich die Zellteilung erheblich verlangsamt. Wenn sich OPCs zu schnell teilen und in weniger als 3 Tagen Konfluenz erreichen, fügen Sie Ara-C (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 2–5 μM für 1–3 Tage hinzu. Aktive Proliferation deutet auf eine verminderte Reifungseffizienz hin.
    3. Untersuchen Sie die Effizienz der oligodendroglialen Reifung, indem Sie die Expression von OL-Markern, z. B. CLDN11, PLP1, MBP durch qPCR, IHC-Färbung oder Immunblotting, bewerten. Die charakteristische Morphologie hochkomplexer Strukturen (Abbildung 1C) und die Expression von OL-Markern (Abbildung 1E) sollten bis zum 28. Tag leicht erkennbar sein.

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Ergebnisse

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figure-results-1
Abbildung 1: iOPC-Generierung (induzierte Oligodendrozyten-Vorläuferzelle) und iOL-Reifung (induzierte Oligodendrozyten). (A) Flussdiagramm der iOPC- und iOL-Erzeugung. (B) Repräsentative Hellfeld- und Immunfluoreszenzbilder von iOPCs an Tag 15. Olig2 (Pan-Oligodendroglia-Marker) ist in grün, O4 (OPC-Marker) in rot und DAPI in blau dargestellt. Die Bildgebung zeig...

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AccutaseSTEMCELL-Technologien7920
B27 BeilageThermoFisher17504044
bFGFThermoFisherPHG 0266
LagerMilliporeSigmaNr. A9501
ClemastinMilliporeSigmaSML0445
DMEM/F12 mittelSTEMCELL-TechnologienArtikel-Nr.: 36254
DmsoThermoFisherNr. D12345
Fötales RinderserumScienCell10
H1 humane ES-ZellenWiCellWA01
MatrigelCorning354234
mTeSR plusSTEMCELL-TechnologienArtikel-Nr.: 5825
N2-ErgänzungThermoFisher17502001
Neurobasal Ein MediumThermoFisherTel.: 10888-022
Nicht essentielle AminosäurenThermoFisherTel.: 11140-050
PDGF-AAF&E-SystemeArtikel-Nr.: 221-AA-010
pMDLg/pRREAddgeneArtikel-Nr.: 12251
PolybreneMilliporeSigmaTR-1003-G
pRSV-REVAddgeneArtikel-Nr.: 12253
ROCK-Inhibitor Y-27632STEMCELL-TechnologienArtikel-Nr.: 72302
sackenTocrisArtikel-Nr.: 4366
STEMdiff Einfriermedien für neuronale VorläuferSTEMCELL-Technologien5838
STEMdiff SMADi Neuronales InduktionskitSTEMCELL-TechnologienNr. 8581
T3 TrijodthyroninMilliporeSigmaNr. T6397
Tempo-iOlogo: Humane iPSC-abgeleitete OPCsTempo BioScienceArtikelnummer102
TetO-NG2-PuroAddgeneArtikel-Nr.: 52047
VSV-GAddgeneArtikel-Nr.: 12259
kg kg

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Oligodendrozyten Differenzierungneurale Vorl uferzellenOligodendrozyten Vorl uferzellenSMAD InhibitorenDMSO BehandlungZellabl sungsl sungOPC DifferenzierungsmediumOL ReifungsmediumAra C Behandlung

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