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>1. Induktion menschlicher Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen
- Lentivirus-Vorbereitung (~5 Tage)
- Platte ~1 Million humane embryonale Nierenzellen 293T (HEK293T) in jedem T75-Kolben, um sie bei der Transfektion zu ~40% konfluent zu haben. Transfizieren Sie sie mit Plasmiden, die das Tetracyclin-induzierbare Neurogenin 2 (Ngn2) und das Puromycin-resistente Gen (PuroR; unter derselben Tet-Operator-Promotor-Kontrolle), den reversen Tetracyclin-Transaktivator (rtTA) und die drei Helferplasmide pRSV-REV, pMDLg/pRRE und VSV-G (12 μg lentivirale Vektor-DNA und je 6 μg der Helferplasmid-DNA) exprimieren. Bereiten Sie mindestens drei Flaschen pro Lentiviruspräparation vor. Verwenden Sie Polyethylenimin (PEI) für die Transfektion gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wechseln Sie das Medium nach 16 h und entsorgen Sie es.
- Ernten Sie freigesetzte Viruspartikel, indem Sie jeden Tag Nährmedien sammeln und 3 Tage lang durch frische Medien ersetzen. Bündeln Sie die gesammelten Medien, die Viruspartikel enthalten, zur Reinigung. Das Virus durch einen 0,22 μm Filter filtrieren und 90 min bei 49.000 x g zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet in dem entsprechenden Volumen an phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)-Glukose (~150 μL).
- Neuronen-Induktion (~5 Tage)
Anmerkung: Dieses Induktionsprotokoll (Abbildung 1A; Flussdiagramm) ist sowohl für induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) als auch für embryonale Stammzellen (ES) mit validierter Pluripotenz hochwirksam (die durch immunhistochemische Färbung gut charakterisierter Pluripotenzmarker getestet werden können; Abbildung 1B).
- Verwenden Sie kommerziell erhältliche humane H1-ES-Zellen bei der Passage von 52 (siehe Materialtabelle). Kultivieren Sie die Zellen auf mit extrazellulärer Matrixlösung beschichteten 6-Well-Platten (~0,5 mg Matrixlösung pro 6-Well-Platte; siehe Materialtabelle) unter Verwendung von ES-Zellerhaltungsmedium (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Platten bei 37 °C mit 5 % CO2.
- An Tag -2 werden ES-Zellen (80 % konfluent) mit 1 ml Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle) abgetrennt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen werden in ein Röhrchen überführt, die Vertiefung mit 2 ml Medium gewaschen und im selben Röhrchen vermischt. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 300 x g, resuspendieren Sie das Pellet in Medien und plattieren Sie die Zellen auf matrixbeschichtete 6-Well-Platten mit einer Aussaatdichte von 1 x 105 Zellen pro Well.
- An Tag -1 werden den ES-Zellen in frischem ES-Zellerhaltungsmedium Lentiviren, die Ngn2 plus PuroR und rtTA exprimieren, zusammen mit Polybren (8 μg/ml) zugesetzt (siehe Materialtabelle). Die genaue Anzahl der Viren sollte durch tatsächliche Titer bzw. die Titration bestimmt werden. In der Regel fügen wir 5 μl pro Virus pro Well in einer 6-Well-Platte hinzu.
- An Tag 0 wird Doxycyclin (2 μg/ml, zur Aktivierung der Ngn2-Expression) in Dulbeccos modifiziertes Medium Eagle Medium/Nährstoffgemisch F-12 (DMEM-F12) mit N2-Supplement ohne Morphogene gegeben.
- An Tag 1 geben Sie Puromycin in frischem Medium aus DMEM-F12 plus N2 und Doxycyclin bis zur Endkonzentration von 1 μg/ml Medium hinzu. Selektieren Sie die transduzierten Zellen in Puromycin für mindestens 24 Stunden. Eine höhere Puromycin-Konzentration (bis zu 5 μg/ml) und ein längerer Selektionszeitraum (bis zu 48 h) können erforderlich sein, um die untertransduzierten Zellen angemessen zu entfernen, wenn der Virustiter niedrig ist.
- An Tag 2 lösen Sie differenzierende Neuronen mit Zellablösungslösung ab (siehe Materialtabelle) und plattieren Sie sie erneut auf 24-Well-Platten (zwischen 80.000 und 200.000 Zellen/Well), die mit Matrixlösung beschichtet sind (siehe Materialtabelle), und halten Sie sie in neurobasalem A (NBA)/B27-Medium ohne Doxycyclin. Die Aussaatdichte ist entscheidend.
- In diesem Stadium können abgelöste Neuronen in einem speziellen kommerziellen Gefriermedium eingefroren werden (siehe Materialtabelle) und bis zu 3 Monate in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Reine Neuronen können unter Berücksichtigung des typischen Zelltods von ~15 % bis 20 % nach dem Auftauen plattiert, allein kultiviert oder mit anderen Gehirnzelltypen co-kultiviert werden (siehe Schritt 3.2.3. für die Co-Kultivierung mit OPCs).
- Kulturieren Sie reine iNs auf den Platten, die mit Lösungen auf Basis extrazellulärer Matrix beschichtet sind, wie vom Hersteller angegeben (siehe Materialtabelle). Die charakteristische pyramidale Morphologie sollte an Tag 4 (und Tag 6; Abbildung 1C). Die Synapsenbildung kann bereits an Tag 14 bis 16 nachgewiesen werden und ist an Tag 24 durch immunhistochemische Färbung mit prä- und postsynaptischen Standardmarkern ausgeprägt. (Abbildung 1D; beschriftet mit dem präsynaptischen Marker Synapsin 1 und dem dendritischen Marker Map2).
>2. Induktion von humanen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) aus pluripotenten Stammzellen und Oligodendrozytenreifung
- Generierung von neuralen Vorläuferzellen (NPC): Monolayer-Protokoll (~7 Tage). Das Flussdiagramm finden Sie in Abbildung 2A.
- Züchten Sie humane H1-ES-Zellen wie zuvor beschrieben (siehe Schritt 1.2.1.) und transdifferenzieren Sie sie zu neuralen Vorläuferzellen (NPCs) nach einem etablierten Ansatz, der als duales SMADi bezeichnet wird, mit niedermolekularen Inhibitoren für mehrere Signalwege. Hier verwenden wir ein weithin akzeptiertes kommerzielles Kit und folgen dem vom Hersteller bereitgestellten Monolayer-Protokoll (siehe Materialtabelle).
- An Tag -1 0,5–1 x 106 Zellen pro Well in einer 6-Well-Platte, beschichtet mit einer wachstumsfaktorreduzierten Matrixlösung (siehe Materialtabelle; ~0,5 mg Matrixlösung pro 6-Well-Platte) mit ES-Zellerhaltungsmedium (siehe Materialtabelle). Diese wachstumsfaktorreduzierte Matrixlösung wird verwendet, um alle Platten zu beschichten, die in den folgenden Schritten verwendet werden.
- An Tag 0 sind die Zellen 24 h lang mit ES-Zellerhaltungsmedium (siehe Materialtabelle) zu behandeln, das mit 2 % DMSO ergänzt wird.
- Tauschen Sie das gesamte Medium an Tag 1 bis 6 durch ein warmes (37 °C) neuronales Induktionsmedium aus, das die SMAD-Inhibitoren aus dem kommerziellen Kit enthält (siehe Materialtabelle). Wenn sich Zellen teilen und vor Tag 7 einen Konfluenz erreichen, passieren Sie sie bis zur Aussaatdichte von 0,5–1 x 106, wie weiter oben in Schritt 2.1.2 beschrieben.
- An Tag 7 wird die Passage der NPCs mit einer Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle) und einer Platte mit einer Aussaatdichte von 1–2 x 105 Zellen/Well einer 24-Well-Platte durchgeführt.
- Bestimmen Sie die Differenzierungseffizienz durch immunhistochemische (IHC) Färbung auf das Fehlen von Pluripotenzmarkern, z. B. Octamer-bindendem Transkriptionsfaktor 4 (OCT4), und das Vorhandensein von NPC-Markern wie gepaarter Box 6 (PAX6), Nestin und Y-Box-Transkriptionsfaktor 1 (Sox1) der geschlechtsbestimmenden Region.
- In diesem Stadium können abgelöste NPCs in den speziellen kommerziellen NPC-Gefriermedien (siehe Materialtabelle) eingefroren und bis zu 3 Monate in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Nach dem Einfrieren und Auftauen behalten NPCs immer noch die Multipotenz, um Neuronen, Astrozyten und OPCs mit zuverlässigen Protokollen hervorzubringen.
- Generierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) (~7 Tage). Das Flussdiagramm finden Sie in Abbildung 2A.
- An Tag 7 werden NPCs mit einer Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle) mit einer Aussaatdichte von 1–2 x 105 Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte in warmem (37 °C) neuronalem Induktionsmedium plus SMAD-Inhibitoren aus dem kommerziellen Kit (siehe Materialtabelle) pergiert.
- Bereiten Sie an Tag 8 eine Lösung von 1% Dimethylsulfoxid (DMSO) im OPC-Differenzierungsmedium vor und behandeln Sie die plattierten NPCs 24 h lang. Das OPC-Differenzierungsmedium setzt sich zusammen aus: DMEM/F12-Medium, 1 % N2-Supplement, 1 % B27-Supplement, basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) bei 20 ng/ml, geglätteter Agonist (SAG) bei 1 μM, Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor-AA (PDGF-AA) bei 10 ng/ml (siehe Materialtabelle).
- Ersetzen Sie an Tag 9 das Medium durch ein frisches OPC-Differenzierungsmedium ohne DMSO. Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag bis zum 15. Tag. Wenn die Zellen vor Tag 15 die Konfluenz erreichen, werden sie auf die Aussaatdichte von 1–2 x 105 Zellen pro Vertiefung gebracht, wie in Schritt 2.2.1 beschrieben.
- An Tag 14 werden OPCs in OPC-Differenzierungsmedium mit einer Dichte von 1–2 x 105 Zellen/Well in einer 24-Well-Platte plattiert.
- In diesem Stadium (Tag 15) testen Sie Zellen durch IHC-Färbung oder qPCR auf das Vorhandensein von OPC-spezifischen Markern (z. B. O4, Oligodendrozyten-Linien-Transkriptionsfaktor [Olig]-1/2, Chondroitinsulfat-Proteoglykan 4/Neuron-Glia-Antigen 2 [CSPG4/Ng2[], NK2 Homeobox 2 [NKX2.2], Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor-Rezeptor alpha [PDGFRa]; Abbildung 2B) und für das Fehlen von NPC-Markern (Pax6 oder Nestin; Abbildung 2D). In der Regel weisen wir die O4-Immunreaktivität in mehr als 95% der Zellen an Tag 15 nach. Von besonderer Bedeutung für die Alzheimer-Krankheit ist die Expression von APP (Amyloid-Vorläuferprotein), BACE1 (die Prozessprotease β-Sekreatase 1) und Peptid-Amyloid-β (Aβ), die in OPCs reichlich vorhanden ist (Abbildung 2F).
>3. Co-Kultivierung von humanen induzierten Neuronen (iNs) und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (iOPCs)
- iOPC-Beschichtung (~3 Tage)
- Platten-iOPCs an Tag 14 mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte (wie oben in Schritt 2.2.4 beschrieben) in OPC-Differenzierungsmedium (wie in Schritt 2.2.2 beschrieben).
- Aufbau der iN-iOPC-Co-Kultur
- An Tag 15 lösen Sie die induzierten menschlichen Neuronen im Schritt von Tag 2 nach der Puromycin-Selektion (wie in Schritt 1.2.6 beschrieben) mit Zellablösung, ab (siehe Materialtabelle).
- Fügen Sie Neuronen zu den kultivierten OPCs hinzu und plattieren Sie sie mit einer Aussaatdichte von 2 x 105 Zellen pro Well in der 24-Well-Platte mit wachsenden OPCs (aus Schritt 3.1.1). Verwenden Sie das Co-Kulturmedium mit Neurobasal-A-Medium, 2 % B27-Supplement und 100 ng/ml T3-Trijodthyronin. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag und danach jeden zweiten Tag. Wenn OPCs zu schnell proliferieren und in weniger als 3 Tagen Konfluenz erreichen, fügen Sie Cytosin-Arabinosid (Ara-C) in einer Konzentration von 2–5 μM hinzu. Ein repräsentatives Bild der iNs und iOPCs, die nach 7 Tagen Neuronen in Co-Kultur gezüchtet wurden, ist in Abbildung 3A dargestellt.
- Verwenden Sie gefrorene Neuronen, die wie oben in Schritt 1.2.7 beschrieben vorbereitet wurden, für die Co-Kultivierung mit OPCs. Platten frieren und tauen Neuronen mit einer höheren Dichte von 3 x 105 Zellen pro Vertiefung auf.
- Nach Tag 14–16 kann die Synapsenbildung in iNs in Kokulturen durch IHC-Färbung von prä- und postsynaptischen Markern beobachtet werden, und bis zum Tag 21 sollten die synaptischen Puncta reichlich vorhanden sein (Abbildung 3C) und neuronale Aktivitäten können zuverlässig aufgezeichnet werden.
- Ab Tag 21 werden die Zellen auf OL-spezifische Marker getestet (z. B. Myelin-Basisprotein [MBP] und Proteolipidprotein 1 [PLP1]). An Tag 28 beobachten wir normalerweise das Phänomen der Umhüllung von iN-Axonen durch iOL-Prozesse, markiert durch IHC-Färbung für spezifische Marker (Abbildung 3B; Neurofilament [NF] für iN-Axone und MBP für iOPC-Prozesse).
