>1. Experimentelle Vorbereitung
- Bereiten Sie Basalmembranmatrix (BMM)-beschichtete Platten vor.
Anmerkung: BMM verfestigt sich bei wärmeren Temperaturen schneller. Die Platten müssen schnell vorbereitet und sofort bei 4 °C gelagert werden.
- Tauen Sie das BMM (siehe Materialtabelle) auf Eis bei 4 °C für mindestens 2 h oder über Nacht auf.
- Mischen Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 und BMM auf eine Endkonzentration von 80 μg/ml. Die BMM-Lösung in Gewebekulturschalen (1 mL für 35 mm und 2 mL für 60 mm Schale) verteilen und mindestens 1 h oder über Nacht bei 37 °C inkubieren, bevor die Zellen plattiert werden.
HINWEIS: Das unbenutzte Geschirr kann bei 4 °C 2 Wochen gelagert werden.
- Bereiten Sie Poly-L-Ornithin/Laminin (PLO/Laminin)-beschichtete Platten vor.
- Bereiten Sie 20 μg/mL PLO (siehe Materialtabelle) in steriler Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS+/+) vor und geben Sie 1 mL in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Über Nacht bei 37 °C im Inkubator inkubieren.
- Am nächsten Tag den PLO mit einem Vakuumsauger ansaugen und zweimal mit DPBS+/+ waschen. In der Kapuze an der Luft trocknen.
HINWEIS: Luftgetrocknete Platten können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert und in Aluminiumfolie eingewickelt für die zukünftige Verwendung gelagert werden.
- Bereiten Sie 10 μg/mL Laminin (siehe Materialtabelle) in DPBS+/+ vor und geben Sie 1 mL in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Mindestens 3 h oder über Nacht bei 37 °C im Inkubator inkubieren.
- Aspirieren Sie das Laminin mit einem Vakuumsauger und fügen Sie entweder 1 ml Medium oder steriles DPBS+/+.
HINWEIS: Die Lamininbeschichtung darf nicht austrocknen. PBS oder ein geeignetes Nährmedium sollte sofort hinzugefügt werden, um dies zu verhindern. Beschichtete Platten können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
- Bereiten Sie die PSC-Passierlösung vor.
- 11,49 g Kaliumchlorid (KCl) und 0,147 g Natriumcitrat-Dihydrat (HOC(COONa) (CH2COONa)2*2H2O) werden in 400 ml sterilem Wasser in Zellkulturqualität gelöst (siehe Materialtabelle).
- Messen Sie das Volumen der Lösung und notieren Sie es als Anfangsvolumen (Vi).
- Messen Sie die Osmolarität und stellen Sie sie auf 570 mOsm ein, indem Sie steriles Wasser in Zellkulturqualität mit der Formel Vi × Oi = Vf × 570 mOsm hinzufügen.
- Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,20-μm-Filter und stellen Sie 10 mL Aliquote her. Lagern Sie die Aliquots bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur (RT).
- Bereiten Sie das Medium für pluripotente Stammzellen (PSC) vor.
HINWEIS: iPSCs werden in einem Medium gehalten, das den hitzestabilen Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) enthält (siehe Materialtabelle), was einen wochenendfreien Fütterungsplan ermöglicht. Andere kommerziell erhältliche PSC-Medien wurden für dieses Protokoll nicht getestet.
- Tauen Sie das PSC-Medium-Supplement über Nacht bei 4 °C auf.
- Fügen Sie 10 ml PSC-Medium-Supplement zu 500 mL basalem PSC-Medium hinzu. 25 mL Aliquote herstellen und bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Gefrorene Aliquots können 6 Monate lang bei -20 °C gelagert werden. Aufgetaute Aliquots müssen bei 4 °C gelagert und innerhalb von 2 Wochen verwendet werden. Die Zellen können für die Langzeitlagerung in einem PSC-Medium mit 10 % (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO) eingefroren werden.
- Bereiten Sie das PSC-Auftaumedium vor.
- Ergänzen Sie das PSC-Medium mit 50 nM Chroman, 1,5 μM Emricasan, 1x Polyamin-Supplement und 0,7 μM trans-ISRIB (CEPT-Cocktail) (siehe Materialtabelle).
- Mit einem 0,20 μm Filter filtrieren und bis zu 4 Wochen bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie gezogene Glaspipetten vor.
- Ziehen Sie 22,9 cm (9 Zoll) Glaspasteurpipetten in zwei Stücke über einem Bunsenbrenner, ~2 cm unterhalb des Halses, und so entstehen zwei Pipetten, wobei die dünnere Seite ~4 cm kürzer ist als die andere.
- Biegen Sie mit Hilfe der Flamme die Spitzen der gezogenen Seite zu einem glatten "r".
- Legen Sie die gezogenen Pipetten in die Autoklavenhülsen und den Autoklavieren zur Sterilisation.
- Bereiten Sie das zerebelläre Differenzierungsmedium (CDM) vor.
- Mischen Sie Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) und Ham's F12 Nährstoffmischung im Verhältnis 1:1. Ergänzen Sie die Mischung mit 1x L-Alanin-L-Glutamin-Supplement, 1% (v/v) chemisch definiertem Lipidkonzentrat, 0,45 mM 1-Thio-Glycerin, 15 μl/ml Apo-Transferrin, 5 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) und 7 μg/ml Insulin (siehe Materialtabelle).
Mit - einem 0,20 μm Filter sterilisieren, bei 4 °C lagern und innerhalb von 1 Monat verbrauchen.
- Bereiten Sie das Kleinhirnreifungsmedium (CMM) vor.
- Ergänzen Sie das neurobasale Medium mit 1x L-Alanin-L-Glutamin-Präparat und 1x N-2-Präparat (siehe Materialtabelle).
Mit - einem 0,20-μm-Filter filtrieren, bei 4 °C lagern und innerhalb von 2 Wochen verbrauchen.
>2. iPSC-Kultur ohne Feeder
- Tauen Sie die Zellen mit den folgenden Schritten auf.
- Legen Sie eine BMM-Platte (Schritt 1.1) in den 37 °C heißen Inkubator, um mindestens 1 h oder über Nacht zu gelieren, bevor Sie die Zellen auftauen.
- 10 ml PSC-Auftaumedium (Schritt 1.5) auf 37 °C vorwärmen.
- Das Kryofläschchen mit den Zellen aus flüssigem Stickstoff in ein Wasserbad bei 37 °C überführen.
HINWEIS: Um eine Kontaminationsquelle im Zellkulturraum zu vermeiden, wird die Verwendung eines Standard-Wasserbades nicht empfohlen. Stattdessen kann Frischwasser in einem kleinen Becherglas auf 37 °C erhitzt werden, um ein einmaliges Wasserbad zu erzeugen.
- Wenn sich noch ein kleines Stück Eis in der Tube befindet, nehmen Sie es aus dem Wasserbad, trocknen Sie die Tube und besprühen Sie sie mit 70 % Ethanol. Übertragen Sie das Röhrchen in die Haube und verwenden Sie eine serologische 2-ml- oder 5-ml-Pipette (siehe Materialtabelle), um die Zellen vorsichtig in ein konisches 15-ml-Röhrchen zu übertragen.
- Geben Sie 8 ml PSC-Auftaumedium tropfenweise in die Zellen, während Sie das konische Röhrchen schwenken. Zentrifugieren Sie bei 200 x g für 5 min bei RT.
- Saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einem Vakuumsauger an, ohne das Kügelchen zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml PSC-Auftaumedium.
- Saugen Sie das BMM aus der Platte ab und fügen Sie die resuspendierten Zellen tropfenweise über die gesamte Platte hinzu, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
- Stellen Sie die Platte bei 37 °C, 5 % CO2 in den Inkubator. Aktualisieren Sie das Medium am nächsten Tag mit PSC Medium. Wechseln Sie danach täglich das Medium.
- Behalten Sie die Zellen bei, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Erwärmen Sie das erforderliche Volumen des PSC-Mediums auf 37 °C (z. B. 1 mL Medium pro 35-mm-Platte).
- Untersuchen Sie die Platten auf differenzierte Zellen oder Kolonien und entnehmen Sie die differenzierten Zellen mit einer gezogenen Glaspipette (Schritt 1.6).
HINWEIS: iPS-Kolonien haben glatte Kanten mit morphologisch identischen Zellen.
- Wechseln Sie das verbrauchte Medium täglich und die Passage alle 3-4 Tage oder wenn 70% Konfluenz erreicht ist.
- Durchgang durch die Zellen.
- Legen Sie die erforderliche Menge an BMM-Platten für mindestens 1 h oder über Nacht in den Inkubator, bevor Sie sie passieren. Die erforderliche Menge PSC-Medium (Stufe 1.3) auf 37 °C vorwärmen.
- Reinigen Sie mit einer gezogenen Glaspipette alle differenzierten Zellen oder Kolonien.
- Saugen Sie das verbrauchte Medium mit einem Vakuumsauger an und fügen Sie PSC-Dissoziationsmedium hinzu, 1 mL pro 35-mm-Schale. Inkubieren bei 37 °C für 1-3 min.
HINWEIS: Wenn die Völker vor der Zugabe von PSC-Medium in der PSC-Passierlösung abheben, kann die Inkubationszeit verkürzt werden.
- Aspirieren Sie die PSC-Passierlösung und fügen Sie vorgewärmtes PSC-Medium hinzu.
- Kratzen Sie mit einer sterilen 200-μl-Pipettenspitze parallel zueinander in eine Richtung, drehen Sie die Platte um 90° und machen Sie einen zweiten Satz Kratzlinien senkrecht zu den vorherigen (wodurch ein schraffiertes Muster über die Platte entsteht).
- Aspirieren Sie die BMM-Lösung aus den Set-Platten. Sammeln Sie die Kolonien mit einer serologischen Pipette und verteilen Sie sie auf neue BMM-Platten.
- Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium täglich.
- Frieren Sie die Zellen ein.
- Bereiten Sie Kryoröhrchen vor, indem Sie den Inhalt etikettieren und unter ultraviolettem (UV) Licht in der Haube (siehe Materialtabelle) 30 Minuten lang sterilisieren.
- Bereiten Sie das PSC-Gefriermedium vor, indem Sie das PSC-Medium mit 10 % (v/v) DMSO ergänzen. Führen Sie die Schritte 2.3.2-2.3.5 aus.
- Übertragen Sie die Zellen mit einer serologischen 5-ml-Pipette in ein konisches 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 200 x g für 5 min bei RT.
- Saugen Sie das Medium vorsichtig an und resuspendieren Sie das Zellpellet in PSC-Gefriermedium.
- In Kryofläschchen verteilen. Stellen Sie die Fläschchen in einen Gefrierbehälter und stellen Sie den Behälter in einen Gefrierschrank von -80 °C.
- Übertragen Sie die Kryofläschchen am nächsten Tag zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff.
>3. Zerebelläre Differenzierung
HINWEIS: Bevor die Differenzierung beginnt, werden die iPSCs auf sechs 35-mm-Schüsseln geleitet und sind bereit für die Differenzierung, wenn sie eine Konfluenz von 70% erreicht haben. Jede 35-mm-Platte wird in eine Vertiefung der 6-Well-Platte übertragen.
- Am Tag 0 heben Sie die gesunden iPS-Kolonien für die EB-Bildung an.
- 1 ml CDM (Schritt 1.7), ergänzt mit 10 μM Y-27632 und 10 μM SB431542 (siehe Materialtabelle), in jede Vertiefung einer 6-Well-ULA-Platte (Ultra-Low Attachment) geben und in den Inkubator stellen, bis die angehobenen Kolonien bereit sind, in die Vertiefungen gegeben zu werden.
- Reinigen Sie die differenzierten Zellen mit einer gezogenen Glaspipette. Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 1 mL PSC-Passierlösung für jede 35-mm-Schale hinzu. 3 min bei 37 °C inkubieren, aspirieren und 2 mL CDM hinzufügen, ergänzt mit 10 μM Y-27632 und 10 μM SB431542,
Anmerkung: Wenn die Kolonien in der PSC-Passierlösung abheben, bevor CDM hinzugefügt wird, kann die Inkubationszeit verkürzt werden.
- Heben Sie die Kolonien unter einem Durchlichtmikroskop vorsichtig mit der gebogenen Kante der gezogenen Glaspipette mit 4-facher Vergrößerung an. Sobald jede Kolonie angehoben ist, übertragen Sie alle mit einer serologischen 10-ml-Pipette vorsichtig in eine Vertiefung der 6-Well-ULA-Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede iPSC-Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2,
Anmerkung: Sind die Kolonien zu groß oder verschmelzen, können sie mit der Spitze der gezogenen Glaspipette in Scheiben geschnitten werden, um kleinere EBs zu erzeugen.
- Geben Sie an Tag 2 FGF2 in jede Vertiefung bis zu einer Endkonzentration von 50 ng/ml.
Anmerkung: Das FGF2, das für die Kleinhirndifferenzierung verwendet wird, ist nicht hitzestabil. Dieses Protokoll wurde nicht mit hitzestabilem FGF2 getestet.
- Machen Sie an Tag 7 einen 1/3 Mediumwechsel. Für 3 ml Gesamtmedium in einer Vertiefung mit einer 1.000-μl-Pipettore 1 ml verbrauchtes Medium vorsichtig aspirieren und durch 1 ml frisches CDM ersetzen. Inkubieren Sie die EBs 7 Tage lang.
- An Tag 14 wird fast das gesamte verbrauchte Medium mit einer 1.000-μl-Pipettore sanft abgesaugt. Um eine minimale Beschädigung der EBs zu gewährleisten, schwenken Sie die Platte, um alle EBs in der Mitte der Platte zu sammeln, kippen Sie dann die Platte und saugen Sie sie langsam vom Rand an.
- Wenn die mittlere Menge abnimmt, legen Sie die Platte langsam flach und ziehen Sie weiter ab. Lassen Sie genügend Flüssigkeit übrig, um ein Austrocknen der EBs zu vermeiden. Fügen Sie anschließend 3 mL frisches CDM hinzu, das mit 10 μM Y-27632 ergänzt wird. Übertragen Sie die EBs mit einer serologischen 10-ml-Pipette in eine PLO/Laminin-beschichtete Schale (Schritt 1.2).
Anmerkung: Abhängig von der Downstream-Anwendung können die EBs auf eine 6-Well-PLO/Laminin-Platte übertragen werden, oder einzelne EBs können in ein einzelnes Well einer PLO/Laminin-beschichteten 24-Well-Platte oder eines Deckglases übertragen werden.
- Aspirieren Sie am 15. Tag das Medium und ersetzen Sie es durch frisches CDM.
Anmerkung: Es ist wichtig, genügend Medium in die Vertiefungen zu geben, um sicherzustellen, dass zwischen den Fütterungen genügend Medium vorhanden ist, da im Laufe der Zeit verdampft (z. B. für eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte 3 ml Medium hinzufügen). Wenn das Medium zu säuern begonnen hat (wird klar und gelb), frischen Sie das Medium auf, auch wenn es bis zum Ende des Protokolls nicht auf dem Fütterungsplan steht.
- Aspirieren Sie am 21. Tag das verbrauchte Medium und ersetzen Sie es durch CMM. Wechseln Sie am 28. Tag das Medium durch frisches CMM. Ernten Sie die Zellen am 35. Tag für weitere Anwendungen.
