Eine Technik zur Erzeugung einer 2D-Monoschicht von Kleinhirnzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Quelle: Madencioglu, D. A., et al. Modellierung der menschlichen Kleinhirnentwicklung in vitro in 2D-Struktur.J. Vis. Exp. (2022).

Dieses Video zeigt ein Protokoll zur Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen in Kleinhirn-Vorläuferzellen. Dabei werden Stammzellkolonien auf eine extrem niedrige Anheftungsplatte übertragen, um Embryoidkörper zu bilden, die Differenzierung mit Wachstumsfaktoren zu fördern und dann die Embryoidkörper zur Adhäsion auf eine matrixbeschichtete Platte zu übertragen. Die nachfolgenden Schritte umfassen die Induktion der Zellmigration und die Zugabe eines Reifungsmediums, um die Entwicklung von glutamatergen und GABAergen zerebellären neuronalen Vorläufern und Purkinje-Zellvorläufern zu steuern.

Protokoll

>1. Experimentelle Vorbereitung

1. Bereiten Sie Basalmembranmatrix (BMM)-beschichtete Platten vor.
   Anmerkung: BMM verfestigt sich bei wärmeren Temperaturen schneller. Die Platten müssen schnell vorbereitet und sofort bei 4 °C gelagert werden.
   1. Tauen Sie das BMM (siehe Materialtabelle) auf Eis bei 4 °C für mindestens 2 h oder über Nacht auf.
   2. Mischen Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 und BMM auf eine Endkonzentration von 80 μg/ml. Die BMM-Lösung in Gewebekulturschalen (1 mL für 35 mm und 2 mL für 60 mm Schale) verteilen und mindestens 1 h oder über Nacht bei 37 °C inku....

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 mL Serologische Pipette	Fisher Scientific	13-678-26D
1-Thio-Glycerin	Sigma	M6145
2 mL Serologische Pipette	Fisher Scientific	Tel.: 13-678-26B
250 mL Filtereinheit, 0,2 μm aPES, 50 mm Durchmesser	Fisher Scientific	FB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Schale	Falke	353001
5 mL Serologische Pipette	Fisher Scientific	13-678-25D
60 mm griffige Gewebekulturschale	Falke	353004
6-Well-Aufsatzplatten mit extrem niedrigem Aufsatz	Corning	Artikel-Nr.: 3471
9" Einweg-Pasteurpipetten	Fisher Scientific	13-678-20D
Apo-Transferrin	Sigma	Nr. T1147
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	Nr. A9418
Wasser in Zellkulturqualität	Cytiva	SH30529.02
Chemisch definiertes Lipidkonzentrat	Gibco	11905031
Chroman 1	Kaiman	Artikel-Nr.: 34681
Klasse II, Typ A2, Biologische Sicherheitswerkbank	NuAire, Inc.	NU-540-600	Haube, UV-Licht
Costar 24-Well-Platte, TC-behandelt	Corning	Artikel-Nr.: 3526
Costar 6-Well-Platte, TC-behandelt	Corning	3516
DMEM	Gibco	11965092
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO (Dimethlysulfoxid)	Sigma	Nr. D2438
DPBS+/+	Gibco	14040133
Emricasan	Kaiman	Artikel-Nr.: 22204
Epi5 episomales iPSC-Reprogrammierungskit	Lebenstechnologien	Nr. A15960
Essential 8-Flex	Gibco	A2858501	PSC-Medium mit hitzestabilem FGF2
Fötales Rinderserum - Premium Select	Atlanta Biologicals	Nr. S11150
FGF2	Peprotech	100-18 Mrd.
GlutaMAX Ergänzung	Gibco	35050061	L-Alanin-L-Glutamin-Ergänzung
Schinkens F12 Nährstoffmischung	Gibco	11765054
HERAcell VIOS 160i CO2-Inkubator	Thermo Scientific	50144906
IMDM	Gibco	12440053
Insulin	Gibco	Artikel-Nr.: 12585
Laminin-Maus-Protein	Gibco	23017015
Matrigel-Matrix	Corning	354234	Basalmembran-Matrix
MEM-NEAA	Gibco	11140050
Mini-Zentrifuge	Labnet International	Nr. C1310	Tisch-Minizentrifuge
N-2 Ergänzung	Gibco	Artikel-Nr.: 17502-048
Neurobasales Medium	Gibco	21103049
PBS, pH 7,4	Gibco	10010023
PFA 16%	Elektronenmikroskopie	Artikel-Nr.: 15710
Polyamin-Ergänzung	Sigma	Nr. P8483
Poly-L-Ornithin (PLO)	Sigma	3655
Kaliumchlorid	Sigma	746436
SB431542	Sigma	Artikel-Nr.: 54317
Durchsichtige selbstverschließbare Beutel	Steriking	SS-T2 (90x250)	Autoklaven-Beutel
Natriumcitrat-Dihydrat	Fisher Scientific	Nr. S279-500
Spritzenvorsatzfilter, steril, PES 0,22 μm, 30 mm Ø	Forschungsprodukte International	256131
Trans-ISRIB	Kaiman	Artikel-Nr.: 16258
Dampfdruck-Osmometer	Wescor, Inc.	Modell 5520	Osmometer
Nr. Y-27632	Biogems	1293823

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